銀杏酚液劑的研制及其生物活性

蔬菜是十字花科植物的主要害蟲之一。長(zhǎng)期以來，對(duì)青蔬菜的防治主要依靠大量的化學(xué)農(nóng)藥的使用，蔬菜生產(chǎn)的r問題（害蟲有抗藥性，害蟲猖獗，農(nóng)藥殘留）日益嚴(yán)重。近年來,人們開始研究開發(fā)無公害農(nóng)藥代替化學(xué)農(nóng)藥防治害蟲,尤其對(duì)開發(fā)和利用植物次生化合物防治害蟲,逐漸受到人們的重視。在漫長(zhǎng)的昆蟲與植物的協(xié)同進(jìn)化過程中,植物形成了許多防護(hù)機(jī)能。植物次生化合物就是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物,在植物與昆蟲的協(xié)同進(jìn)化中起著主導(dǎo)作用。銀杏的次生代謝產(chǎn)物有銀杏酮、銀杏內(nèi)酯、銀杏酚、銀杏酸等多種化合物,其中銀杏酮、銀杏內(nèi)酯已被開發(fā)為治療心腦血管疾病的藥物。銀杏酚、銀杏酸是控制害蟲作用的活性成分,具有防治農(nóng)業(yè)害蟲的作用,主要存在于葉和外種皮中。銀杏外種皮中銀杏酚含量較高,在15%以上。銀杏酚是烴基酚,如13-烷基苯酚、15-烷基苯酚、15-烯基苯酚等。雖然一些文獻(xiàn)報(bào)道了銀杏酚酸類化合物具有防治菜青蟲的作用,但是,目前還未見到關(guān)于測(cè)定銀杏酚防治菜青蟲的防治效果的報(bào)道。為了搞清楚銀杏酚對(duì)菜青蟲的防治效果和拒食活性,為利用銀杏外種皮研制防治菜青蟲的新型殺蟲劑提供依據(jù),本研究從銀杏外種皮中提取銀杏酚等提取物,進(jìn)行了測(cè)定銀杏酚對(duì)菜青蟲拒食活性的研究。1實(shí)驗(yàn)1.1銀杏外土的選擇從邳州市炮車鎮(zhèn)圍北村的蘇州青青菜地中采集菜青蟲,挑選健康的,大小一致的三齡和四齡幼蟲供試驗(yàn),試驗(yàn)前饑餓5h。銀杏外種皮購(gòu)于邳州市國(guó)家銀杏博覽園,邳州市港上鎮(zhèn)。熒光硅膠,規(guī)格G型,浙江雁蕩山試劑廠。1.2方法1.2.1提取、濃縮、分離將銀杏外種皮曬干、去雜、粉碎至粒徑1mm,用水提取2次以去除糖類等水溶性無效物質(zhì),將提取液放掉或作他用。殘留物質(zhì)再用乙醇提取2次,過濾提取液,并將提取液蒸發(fā)、濃縮成膏狀,得粗提取物。將粗提取物用硅膠薄層析板分離法提純。溶劑為氯仿,展開劑為氯仿∶乙酸乙酯∶乙酸=90∶10∶1(體積比),洗脫劑為氯仿,分離出銀杏酚含量較高的提取物,得精提物。1.2.2氣相色譜條件委托南京大學(xué)現(xiàn)代分析中心對(duì)提取物進(jìn)行定性/定量分析。檢測(cè)設(shè)備為氣質(zhì)聯(lián)用儀。氣相色譜條件:DB-5毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm);氣化溫度250℃;柱溫150℃;保持1min,然后以升溫速率12℃/min升溫至290℃。1.2.3銀杏酚液劑的制備銀杏酚是脂溶性化合物。將精提物溶于氯仿,加適量的對(duì)昆蟲無影響的烷基酚聚氧乙烯醚乳化劑,制備含12.6%銀杏酚的水溶性液劑,稱作銀杏酚液劑。1.2.4葉碟葉碟的制備用水為溶劑,把銀杏酚液劑用梯度稀釋法,分別稀釋50、100、150、200倍4個(gè)濃度梯度。采用葉碟法,用打孔器(直徑20mm),將新鮮的蘇州青青菜的菜葉打成葉碟,放入稀釋液浸5s取出,另設(shè)清水對(duì)照組,待葉碟干后,置于直徑為9cm培養(yǎng)皿中,內(nèi)墊濾紙加少量蒸餾水保濕。每皿6片,接入饑餓5h的試蟲一頭,5頭為一重復(fù),處理1～7天,分別用方格紙測(cè)定取食面積。每天測(cè)定后,換掉試蟲取食后的殘片,其余葉碟保留。拒食率按以下公式計(jì)算:拒食率=(對(duì)照組取食量-處理組取食量)/對(duì)照組取食量×100%2結(jié)果與分析2.1五烷基苯酚氣質(zhì)分析結(jié)果表明:精提物含十六酸乙酯0.82%;十八烯酸乙酯1.16%;十三烷基苯酚12.18%;十五烯基苯酚65.03%;十五烷基苯酚17.58%;十五烷基間二苯酚0.01%;二十九烯-140.97%。其中銀杏酚,如十三烷基苯酚,十五烷基苯酚,十五烯基苯酚等含量為94.80%。2.2拒食率及拒食速率從表1～表2中可以看出,銀杏酚對(duì)菜青蟲三、四齡幼蟲有明顯拒食作用。對(duì)三齡幼蟲拒食率在30.1%～81.5%,處理1天后,拒食率較低,處理2天后,200倍稀釋液對(duì)三齡幼蟲拒食率達(dá)77.4%。對(duì)四齡幼蟲拒食率在31.9%～85.3%。50倍和150倍稀釋液,處理5天后,拒食率分別上升至70.0%和74.0%。200倍稀釋液拒食作用較差,處理4天以后,三齡、四齡幼蟲拒食率分別下降至30%和40%左右?？偲饋砜?銀杏酚液劑稀釋150倍以下,對(duì)菜青蟲拒食作用較大,對(duì)三齡幼蟲優(yōu)于對(duì)四齡幼蟲的拒食作用。2.3稀釋液處理對(duì)四齡幼蟲的效果在進(jìn)行銀杏酚對(duì)菜青蟲三齡、四齡幼蟲拒食活性測(cè)定的同時(shí),還對(duì)試蟲的死亡和變蛹情況進(jìn)行了觀察和統(tǒng)計(jì):三齡幼蟲的清水對(duì)照組,喂飼11～12天全部變蛹。用銀杏酚液劑100、150倍稀釋液處理的三齡幼蟲全部死亡。200倍稀釋液處理的三齡幼蟲,約20%變蛹,80%死亡。四齡幼蟲清水對(duì)照組,喂飼6～7天全部變蛹,用50、100、150倍稀釋液處理的四齡幼蟲,除個(gè)別變蛹外,其余死亡;200倍稀釋液處理四齡幼蟲,約40%變蛹,60%死亡。50倍稀釋液處理四齡幼蟲,死亡時(shí)間為處理后5～7天。其余稀釋液處理的幼蟲,全部發(fā)育為超齡幼蟲,超齡2～16天后死亡或變蛹。因多數(shù)試蟲死亡時(shí)間是在發(fā)育成超齡幼蟲后,即使50倍稀釋液處理的四齡幼蟲,死亡時(shí)間也是在清水對(duì)照組的變蛹期,所以試蟲死亡對(duì)于減少菜青蟲對(duì)蔬菜危害意義不大了,但可以大大減少幼蟲發(fā)育成蛹的數(shù)量,對(duì)預(yù)防菜青蟲再次發(fā)生具有控制作用。2.4銀杏酚抑制酶系統(tǒng)成分酶活性銀杏酚是烷基酚類化合物。對(duì)于烷基酚類化合物的生物活性的研究工作,國(guó)外開展的較早,主要是研究腰果殼中的烷基酚化合物(銀杏外種皮大部分烷基酚類化合物與腰果殼中的相同)并發(fā)現(xiàn)它們具有多種生物活性。它們是某些重要酶的抑制劑,如烷基酚是酪氨酸酶、15-脂肪氧合酶、磷脂酶CγI、丙三醇-3-磷酸鹽脫氫酶等酶的抑制劑。Isaokubo報(bào)道了漆酚酸可抑制昆蟲前胸腺合成酶的活性。漆酚酸是13碳～17碳烷基酚類或烷基酚酸類化合物。前胸腺合成的激素為蛻皮激素。蛻皮激素主要作用外胚層來源的真皮組織,如真皮細(xì)胞、器官芽細(xì)胞或神經(jīng)系統(tǒng)消化道等相應(yīng)的內(nèi)部器官。蛻皮激素刺激真皮細(xì)胞,細(xì)胞核內(nèi)染色體某些部位即出現(xiàn)“膨脹”,此標(biāo)志DNA的螺旋被打開,將遺傳密碼轉(zhuǎn)錄子mRNA上,mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),將所攜帶的信息在那里用于合成特定的蛋白質(zhì),主要是酶的合成,如酪氨酸酶等,將使酪氨酸經(jīng)一系列變化成為蛻皮后新表皮所需的硬化物質(zhì),表現(xiàn)為新表皮的生長(zhǎng)與舊表皮脫去及蟲體的長(zhǎng)大。由于銀杏酚抑制了酪氨酸酶的活性或抑制了酶合成,使酪氨酸不能發(fā)生一系列變化,不能生成蛻皮后新表皮所需的硬化物質(zhì),影響了試蟲的正常蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)育,使試蟲表現(xiàn)為拒食和發(fā)育為超齡幼蟲,甚至不能形成蛹而致死。如今對(duì)昆蟲的一些激素及其類似物已在若干重要害蟲(如二化螟、庫(kù)蚊、體虱、麗蠅、黃粉蝶和蚜等)中廣泛地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),并取得了一定的控制效果,因而有些人主張用昆蟲激素或動(dòng)植物中提取的同功物質(zhì),試圖阻止昆蟲正常生長(zhǎng)發(fā)育或致其死亡。此工作受到各國(guó)的重視,并以此作為發(fā)展新型殺蟲劑的一個(gè)新方向,稱其為第三代新型殺蟲劑。3銀杏酚防治菜青蟲3.1銀杏酚對(duì)菜青蟲具有明顯的拒食活性。銀杏酚對(duì)菜青蟲的防治作用,是以拒食作用和驅(qū)蟲作用為主的,稀釋液中銀杏酚含量越高,防治時(shí)間越早,防治效果越好。3.2由于銀杏酚抑制了酪氨酸酶的合成或活性,影響了菜青蟲的正常蛻皮和生長(zhǎng)發(fā)育,使其發(fā)育為超齡幼蟲,超齡2～16天,致使在進(jìn)行銀杏酚防治菜青蟲田間藥效試驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)菜青蟲死亡