便秘模型造模方法的研究

便秘是大便隱匿結(jié)節(jié)、大便時(shí)間延長(zhǎng)或大便困難的一種疾病。便秘雖然不會(huì)直接致命,但它是引起很多疾病的間接原因,是身體提早衰老的一種表現(xiàn)。長(zhǎng)期的便秘,會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)產(chǎn)生的有害物質(zhì)不能排除從而引起腹脹、口臭、食欲減退和易怒等自體中毒癥狀。便秘有時(shí)是誘發(fā)心肌梗死、腦出血等嚴(yán)重病癥的潛在原因,慢性便秘也是結(jié)腸癌的危險(xiǎn)誘因,其防治不容輕視。然而國(guó)內(nèi)便秘模型或抗便秘藥物研究力量相對(duì)弱小,模型制作與觀測(cè)指標(biāo)研究缺乏深度,從而影響了抗便秘藥物的研發(fā)。作者對(duì)動(dòng)物便秘模型的研究方法進(jìn)行整理,以期對(duì)便秘動(dòng)物模型的進(jìn)一步研究提供參考。1大鼠便秘模型的構(gòu)建方法1.1豎毛及解剖結(jié)果該模型的造模方法是選用健康小鼠,禁水不禁食72h。造模成功后小鼠外觀干癟瘦小,稍有豎毛,活動(dòng)少,尿色深黃,體重下降3g以上。大便干結(jié)成圓珠狀,含水量由正常平均值60%~70%下降為30%~40%。解剖見糞粒積結(jié)在結(jié)腸,呈圓珠狀或串珠狀,空腸、回腸內(nèi)內(nèi)容物少。該模型制備簡(jiǎn)單,成功率高。但禁水不禁食72h違反實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求,值得商榷。1.2co放療系統(tǒng)甲狀腺素可使機(jī)體代謝加快,利血平抑制腎上腺素能神經(jīng)功能,耗竭耗竭周圍交感神經(jīng)末梢的腎上腺素,交感神經(jīng)的功能受到遏制,副交感神經(jīng)的功能相對(duì)占優(yōu)勢(shì),兩者并用可加速機(jī)體陰虛。60Co照射可損害血液系統(tǒng)致血流滯緩。蔡光先等每天給每只小鼠灌胃3mg甲狀腺素和0.02mg利血平,連續(xù)7d。第6天予60Co放療機(jī)以100RAD對(duì)小鼠進(jìn)行照射致微循環(huán)障礙,微血管滲出性和出血性改變,并禁水1d。第7天,各造模組小鼠表現(xiàn)出體重下降、心率增快、躁動(dòng)不安、飲水增加、唇舌暗紫、糞便干結(jié)量少等便秘癥狀。1.3脾虛型便秘模型1.3.1醋的長(zhǎng)期灌胃王嵐等根據(jù)“味過于酸,肝氣以津,脾氣乃絕”的中醫(yī)理論,通過喂飼山西白醋和0℃活性炭冰水復(fù)制小鼠陽(yáng)虛便秘模型,具體方法:首劑量按0.3mL/只灌胃給醋,第二天起按0.01mL·g-1劑量給醋,連續(xù)9d;自第7天起,給醋的同時(shí)按0.04mL·g-1給予10%的0℃活性炭冰水,連續(xù)3d。結(jié)果模型小鼠的首粒排黑便時(shí)間延遲、3h內(nèi)排黑便粒數(shù)減少、腸推進(jìn)率降低,與臨床陽(yáng)虛便秘的某些癥狀相似。該模型復(fù)制簡(jiǎn)便,但模型復(fù)制過程中小鼠的死亡率較高,造模時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加樣本量。1.3.2小鼠的脾融入共同方式鄭學(xué)寶等對(duì)小鼠先采用隔天進(jìn)食致饑飽失常,并每天游泳2次,每次5min致過度疲勞,連續(xù)12d,造成實(shí)驗(yàn)小鼠的脾虛狀態(tài),然后從第13天開始禁水僅以大米喂養(yǎng),連續(xù)3d以造成失水燥結(jié),結(jié)果小鼠出現(xiàn)了皮松毛豎、缺乏光澤、活動(dòng)減少、消瘦、小便不黃等脾虛和大便干結(jié)的表現(xiàn),具有脾虛便秘的特征。1.3.3造模、解剖處理第1~7天用番瀉葉按0.8mL·d-1給小鼠灌胃,正常飲食飲水,造成脾虛狀態(tài)。第8天起停用番瀉葉,隔天喂低纖維飼料生大米4~8g,自由飲水1次,每次0.5h,造模時(shí)間共15d。造模成功后,小鼠外觀干癟、瘦小、豎毛、拱背、活動(dòng)減少,體重減輕,大便干結(jié)、數(shù)量減少、顆粒細(xì)小;解剖見大便集結(jié)在結(jié)腸,呈球狀或串珠狀,空腸、回腸無(wú)明顯糞便殘留;腸道推進(jìn)率和血清D-木糖水平降低。1.4藥物便秘的模型1.4.1灌胃時(shí)間和排氣時(shí)間硫糖鋁廣泛用于治療胃、十二指腸潰瘍及胃炎,但其致便秘的副作用也頗受重視。陳芳等利用這一性質(zhì),按2.08g·kg-1給小鼠灌胃,每天1次,連續(xù)3d,結(jié)果小鼠首次排便時(shí)間延遲、排便粒數(shù)明顯較少,腸道推進(jìn)運(yùn)動(dòng)減弱,水分吸收增加。該模型操作簡(jiǎn)便,有助于深入研究便秘的發(fā)生機(jī)制。1.4.2小鼠作為大鼠的作為復(fù)方地芬諾酯(DC)能加強(qiáng)腸張力,抑制腸蠕動(dòng),使腸內(nèi)容物通過延遲,腸內(nèi)水分吸收增加,造成動(dòng)物排便減少。萬(wàn)錦州等將小鼠禁食12h后,按50mg·kg-1一次灌胃給予DC,結(jié)果模型小鼠排便粒數(shù)顯著減少。該模型極易操作,有利于快速篩選具有潛在通便作用的藥效物質(zhì)。1.4.3小鼠腸道推進(jìn)率和腸道ca-傳統(tǒng)道德模型的慢傳輸型臟器小鼠腸道詞缺乏對(duì)小鼠腸道推進(jìn)率的影響許海塵等按2.5mg·kg-1的劑量每日給小鼠皮下注射鹽酸嗎啡1次,連續(xù)45d,結(jié)果小鼠每天平均糞便質(zhì)量減輕,腸道推進(jìn)率減低,c-kit陽(yáng)性細(xì)胞面積比減少,該模型適合研究與阿片受體和腸道Cajal細(xì)胞相關(guān)的慢傳輸型便秘(STC)的發(fā)生機(jī)制。2大鼠便秘模型的構(gòu)建方法2.1大鼠前前1天糞便干燥王朝暉等連續(xù)5d測(cè)每只大鼠的日飲水量及大便量,取大鼠正常每日飲水量均數(shù),于第1,2天分別給前5d平均水量的1/6,第3~6日給1/3,取整數(shù)值。給水時(shí)間為上午8:00和晚上10:00,結(jié)果模型大鼠出現(xiàn)糞便干燥如豌豆樣圓珠狀便秘表現(xiàn)。該模型適用于功能性便秘的發(fā)生機(jī)制和通便藥物的治療作用研究。2.2大鼠30d飼食、飲水對(duì)小鼠腸道粒數(shù)的影響朱軍等以2mL/只的量給大鼠灌胃冰水(0~4℃,生理鹽水),1次/d,共14d,正常飼食、飲水。結(jié)果顯示:經(jīng)2周的冰水灌胃刺激,模型大鼠24h糞便粒數(shù)減少,質(zhì)量減輕,小腸墨汁推進(jìn)率顯著低于正常對(duì)照組。冰水灌胃組大鼠的腸功能紊亂表現(xiàn)可保持至灌胃結(jié)束后2周,表明反復(fù)冰水灌胃對(duì)腸道運(yùn)動(dòng)、分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的影響持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),該模型具有很好的穩(wěn)定性。2.3大鼠的排氣時(shí)間大鼠每天上午8:00灌胃給予山西白醋,首劑量5mL/只,第2天起即按3mL/200g體重給醋,給醋2h后,每鼠按5mL/200g體重灌胃給予16.67mol·L-10℃活性炭冰水,連續(xù)9d。結(jié)果模型動(dòng)物的首粒排便時(shí)間明顯延遲,6h內(nèi)排便粒數(shù)明顯減少,結(jié)腸收縮頻率明顯降低、結(jié)腸收縮幅度減弱,胃腸激素、腸神經(jīng)遞質(zhì)分泌紊亂。該模型具有重復(fù)性好,復(fù)制簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、自然恢復(fù)較慢等優(yōu)點(diǎn)。2.4大鼠糞便模型用低纖維飼料(41.5%的玉米淀粉,24.5%的牛奶酪蛋白,10.0%蔗糖,10.0%糊精,7.0%的礦物質(zhì),6.0%的玉米油,1.0%維生素)連續(xù)飼喂大鼠5周,結(jié)果模型組的糞便質(zhì)量、糞便含水量相對(duì)于正常飲食組顯著降低,此便秘模型的造模方法簡(jiǎn)單,易于操作,可用于與結(jié)腸功能失調(diào)相關(guān)的致便秘機(jī)制研究。2.5大鼠腸壁感染吳先哲等采用直腸部分縮窄法造模,將大鼠麻醉后,開腹暴露直腸,10號(hào)絲線經(jīng)腹壁從距肛門1~1.5cm處“8”字形從直腸下繞過再經(jīng)腹壁引出,絲線引入點(diǎn)和引出點(diǎn)在腹壁相距約0.5cm。在引出的絲線內(nèi)套入直徑為0.5cm的鐵絲打結(jié),退出鐵絲后,直腸被部分縮窄并懸吊于腹壁,但腸壁血運(yùn)正常。關(guān)閉腹腔,大鼠蘇醒后予正常飲食。造模后大鼠無(wú)排便,直腸結(jié)扎線以上密集地存積堅(jiān)硬的糞便,腸管明顯擴(kuò)張充血。大鼠血漿內(nèi)皮素(ET)水平和血清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量較正常組顯著升高,與臨床出口梗阻性便秘患者的某些癥狀相似。2.6藥物便秘的模型2.6.1大鼠的攝食量和糞便排出量的變化洛哌丁胺作用于腸壁的阿片受體,阻止乙酰膽堿和前列腺素的釋放,從而抑制腸蠕動(dòng),延長(zhǎng)腸內(nèi)容物的滯留時(shí)間致便秘。于每日9:00和18:00給大鼠皮下注射洛哌丁胺(1.5mg·kg-1)2次,連續(xù)5d。造模后,大鼠的攝食量、糞便排出量顯著降低,腸內(nèi)糞便量約是對(duì)照組的2倍,盲腸和結(jié)腸的糞便量重于對(duì)照組,糞便含水量較對(duì)照組少5%~10%。腺上皮細(xì)胞含黏液與黏膜表面黏液均較少,糞便表面的黏液層較薄,表明洛哌丁胺引起便秘使腺上皮細(xì)胞黏液的產(chǎn)生減少,該模型的研究有助于探討抗便秘藥物的作用機(jī)制。2.6.2大鼠結(jié)腸慢波的變化復(fù)方苯乙哌啶直接作用于腸道平滑肌使腸道蠕動(dòng)減慢致便秘,劉海峰等用含復(fù)方苯乙哌啶的飼料飼喂大鼠,給藥劑量為8mg·kg-1體重,連續(xù)喂養(yǎng)120d。結(jié)果模型大鼠首粒黑便排出時(shí)間顯著延長(zhǎng),結(jié)腸慢波出現(xiàn)雙向改變,部分大鼠結(jié)腸慢波頻率明顯減慢,振幅增加,波形仍表現(xiàn)為不規(guī)則的近似正弦波樣曲線;部分大鼠結(jié)腸慢波頻率出現(xiàn)快速性改變,振幅強(qiáng)弱不等,波形較不穩(wěn)定,且出現(xiàn)基線位移,與便秘患者具有相似的臨床癥狀和病理生理改變。該模型簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì),可重復(fù)性強(qiáng),但造模時(shí)間較長(zhǎng)。2.6.3首次灌胃鹽酸小堿對(duì)大鼠小鼠小鼠小鼠排黑便時(shí)間的影響小檗堿屬異喹啉類生物堿,是一種抗菌消炎的常用藥,臨床治療發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期服用小檗堿有致便秘的現(xiàn)象。我們以50mg·kg-1的劑量連續(xù)給大鼠灌胃鹽酸小檗堿14d后,與空白組比較,大鼠的首次排黑便時(shí)間延長(zhǎng)、6h內(nèi)排便粒數(shù)減少、糞便含水量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),便秘模型建立。該模型造模時(shí)間較短,原料易得,操作簡(jiǎn)單,可用于腸管炎癥引起的器質(zhì)型便秘的研究。2.6.4對(duì)大鼠的影響具體方法為:不禁食,限水,致大鼠形成便秘;然后用大黃、酚酞灌胃給予治療,起始劑量為每天200μg·g-1·d-1,按每天20μg·g-1·d-1遞增,至約半數(shù)以上動(dòng)物出現(xiàn)稀便時(shí),再維持此劑量不變,使大鼠對(duì)藥物產(chǎn)生依賴,再逐漸停止限水,大黃最終用量3.2mg·g-1·d-1,酚酞最終用量4.2mg·g-1·d-1,再以此劑量飼養(yǎng)3個(gè)月,結(jié)果與正常對(duì)照組比較,各模型組小腸推動(dòng)率減慢,首例大便排出時(shí)間延長(zhǎng),排便量少,大便內(nèi)酚紅含量減少,模型建立成功,該模型可重復(fù)性強(qiáng),有助于研究臨床上由于長(zhǎng)期服用瀉藥引起的藥物依賴性便秘。3粘土便秘模型的構(gòu)建方法3.1培養(yǎng)成大鼠糞便濕重家兔喂飼料前以1mg·kg-1皮下注射嗎啡,以抑制攝食后2.5h內(nèi)自然排便濕重增加。喂飼料后即刻灌服實(shí)驗(yàn)藥物,收集食后2.5h內(nèi)糞便,計(jì)算糞便含水量。嗎啡1mg·kg-1顯著抑制攝食后2.5h內(nèi)糞便濕重為對(duì)照組的37.5%,糞便含水量無(wú)變化,紅霉素A衍生物(GM-611)5mg·kg-1灌服2.5h內(nèi)抑制嗎啡便秘模型的糞便濕重減少,所有糞便成形或軟便,無(wú)動(dòng)物出現(xiàn)腹瀉,不增加糞便含水量。證明嗎啡便秘模型有很好的適用性。3.2大鼠腸道組織前突后模型模型組家兔麻醉成功后,四肢分別固定在兔子解剖臺(tái)上,完全暴露家兔肛門部。用小三角針在“模具”(自行制作)的敞開端分別縫上4根“4”號(hào)線,距離邊緣約0.2cm,4根線拉直后呈“十”字形,應(yīng)仔細(xì)檢查4根線避免之間有交叉。用4針分別固定于直腸正中線2側(cè),左右各兩針,使模具圓錐形的封閉端固定于直腸前壁上。上2針距離肛門緣約2cm,下2針距離肛門緣約0.8cm(至少0.5cm),均在肛門括約肌以上。仔細(xì)打結(jié)固定,檢查模具的位置,一定使封閉端頂在直腸前壁上。1個(gè)月后形成直腸前突后取出,再飼養(yǎng)2個(gè)月。結(jié)果模型組家兔大便粒數(shù)及大便質(zhì)量明顯減少,結(jié)直腸總長(zhǎng)度變長(zhǎng),胃腸傳輸時(shí)間增加,與對(duì)照組比較差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃?jiǎn)單可靠,重復(fù)性強(qiáng),符合便秘的發(fā)病過程4-ht受體三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林通過抑制去甲腎上腺素與5-羥色胺(5-HT)再攝取,下調(diào)去甲腎上腺素與5-HT受體產(chǎn)生抗膽堿作用而引起獼猴便秘。其方法是:雄性猴上午9時(shí)經(jīng)鼻胃管飼5%阿拉伯膠阿米替林混懸液(60mg·kg-1),給藥1h后喂飼料150g,觀察癥狀。獼猴給藥后4h出現(xiàn)蹲伏位,至24h后恢復(fù)正常,無(wú)排便,而對(duì)照猴頻繁排便。該便秘模型適用于評(píng)價(jià)瀉藥的抗便秘作用。5溴莫尼定的劑量依賴正常雄性雪貂的排便類型為攝食后3~5h自然排便頻率增加,溴莫尼定和嗎啡均可抑制胃腸轉(zhuǎn)運(yùn)致便秘。雪貂攝食后1.5h后,皮下注射嗎啡0.3mg·kg-1,或溴莫尼定3μg·kg-1以抑制攝食后排便頻率增加,攝食后3h口服實(shí)驗(yàn)藥物觀察排便頻率和收集2h糞便,以干濕糞便質(zhì)量差估計(jì)含水量。結(jié)果顯示,攝食后1.5h給溴莫尼定劑量依賴地抑制攝食后3~5h內(nèi)排便量,而糞便中含水量無(wú)顯著改變,嗎啡劑量依賴地降低排便頻率和糞便含水量。該模型有助于研究腸道平滑肌功能紊亂引起的便秘。6改善造模的臨