十八反藥對(duì)白與制川烏配伍的體外化學(xué)機(jī)制研究

“白鹿原”是“十八年原”中“半酒吧、攻擊烏爾”的內(nèi)容之一。然而在《千金要方》中卻有記載白蘞與烏頭治癥瘕之鎮(zhèn)心丸,在臨床上也不乏用制川烏與白蘞治寒濕頑痹?！夺t(yī)學(xué)心語(yǔ)》記載普救萬(wàn)全膏使用川烏、草烏配伍白蘞、川芎和牛膝治療“一切風(fēng)寒濕氣,走注疼痛”等證以及腹中食積痞塊、小兒疳積、女人癥瘕、咳嗽等疾病。因此開(kāi)展“十八反”的基礎(chǔ)研究,迫切需要科學(xué)闡釋相反作用機(jī)制,為中醫(yī)臨床用藥安全有效提供指導(dǎo)。目前對(duì)于制川烏與白蘞的配伍研究主要在臨床應(yīng)用和藥理方面,研究發(fā)現(xiàn)兩者配伍使用小鼠死亡數(shù)和毒性未見(jiàn)增加,反而可以增強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用。也有臨床報(bào)道白蘞與制川烏合用有抗腫瘤的作用等。而對(duì)其配伍前后主要化學(xué)成分及其量變化研究報(bào)道幾乎沒(méi)有。本實(shí)驗(yàn)采用高分離快速液相色譜串聯(lián)四級(jí)-飛行時(shí)間質(zhì)譜(RRLC-Q-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù),結(jié)合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法及方差分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,探討制川烏與白蘞配伍煎煮后的主要化學(xué)成分的變化規(guī)律,并對(duì)其變化機(jī)制進(jìn)行初步探討,從體外化學(xué)的角度為揭示兩者配伍相反的科學(xué)內(nèi)涵研究奠定基礎(chǔ)。1材料和試劑制川烏AconitiRadixCocta購(gòu)自于四川江油,白蘞購(gòu)自安徽六安中藥材市場(chǎng),經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥副教授鑒定分別為毛茛科烏頭屬植物川烏AconitumcarmichaeliiDebx.的干燥母根炮制品、葡萄科白蘞Ampelopsisjaponica(Thunb.)Makino的塊根。標(biāo)本(編號(hào)110501)收藏于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部。甲酸為色譜純,購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;乙腈為色譜純,購(gòu)自ThermoFisherScientific公司;超純水由杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司提供。對(duì)照品烏頭堿(批號(hào)110720-200410,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、次烏頭堿(批號(hào)110798-200805,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、中烏頭堿(批號(hào)110799-200505,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、14-苯甲酰次烏頭原堿(批號(hào)111796-201002,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、14-苯甲酰中烏頭原堿(批號(hào)111795-200901,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)、沒(méi)食子酸(批號(hào)110831-200302)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;對(duì)照品14-苯甲酰烏頭原堿(批號(hào)B-010-110916,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,成都瑞芬思生物科技有限公司),純淀粉(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠)。2方法和結(jié)果2.1四川富與白鹿醇的外化學(xué)研究2.1.1水再回流提取法分別精密稱取1g制川烏置圓底燒瓶中,加入10倍量的水浸泡1h,回流提取1h,分別加入0、0.25、0.5、1、3g浸泡1h的白蘞,回流提取,合煎30min,待冷卻后轉(zhuǎn)移至離心管中,3500r/min離心10min,將煎煮液轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中,沉淀分別加入8倍量的水再回流提取1.5h,待冷卻后離心10min,合并2次煎煮液,蒸餾水定容至100mL。每個(gè)配伍比例平行3份。沉淀使用95%乙醇洗滌4次,3500r/min離心10min,將上清液轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,合并2次上清液用95%乙醇定容至刻度。將定容好的樣品分別在12000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min,取出600μL于離心管中,渦旋混均,離心10min,4℃保存,待測(cè)。2.1.2u3000定量采用AgilentZorbaxEclipsePlusC18(100mm×2.1mm,1.8μm)色譜柱;柱溫為40℃;體積流量為0.3mL/min;進(jìn)樣量為5μL;流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脫:0~2min,99%A;2~5min,99%~94%A;5~15min,94%~90%A;15~30min,90%~80%A;30~31min,80%~70%A;31~36min,70%~50%A;36~38min,50%~30%A;38~39min,30%~1%A;39~41min,1%A。2.1.3離子源溫度分布采用電噴霧離子源(ESI),正離子V模式檢測(cè);m/z100~1000;毛細(xì)管電壓為4kV;錐孔電壓為35V;離子源溫度為120℃;霧化溫度為300℃;殼氣體積流量為900L/h;干燥器溫度350℃;以亮氨酸-腦啡肽進(jìn)行精確質(zhì)量校正([M+H]+m/z556.2771)。2.1.4峰齊性及峰齊性的研究質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Simca-p軟件進(jìn)行PLS-DA分析、峰提取、峰對(duì)齊及歸一化等處理,分析不同配伍比例之間存在的差異性以及對(duì)主要生物堿成分的變化趨勢(shì)。2.2方法研究2.2.1儀器精密度試驗(yàn)按照上述“2.1.1”項(xiàng)下方法制備制川烏-白蘞(1∶1)配伍供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,隨機(jī)選取20個(gè)色譜峰,經(jīng)計(jì)算20個(gè)色譜峰峰面積的RSD小于2%,保留時(shí)間的RSD小于0.7%,表明儀器精密度良好。2.2.2進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗(yàn)平行制備制川烏-白蘞(1∶1)配伍供試品試液6份,依次進(jìn)樣分析,選取“2.2.1”項(xiàng)下20個(gè)色譜峰,經(jīng)計(jì)算各色譜峰峰面積的RSD小于5%,保留時(shí)間的RSD小于2%,表明重復(fù)性良好。2.2.3進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗(yàn)按照“2.1.1”項(xiàng)下的方法制備制川烏-白蘞(1∶1)配伍供試品溶液,分別在0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)樣分析,隨機(jī)選取20個(gè)色譜峰(同“2.2.1”),經(jīng)計(jì)算各色譜峰峰面積的RSD小于2%,保留時(shí)間的RSD小于1%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3r爾克-q-tofms分析的結(jié)果2.3.1質(zhì)譜圖的測(cè)定13種生物堿類化合物鑒定結(jié)果見(jiàn)表1,其中[M+H]+m/z646、616、632、590、604、574離子的質(zhì)譜圖與對(duì)照品的質(zhì)譜圖比較,可以確定峰13為烏頭堿([M+H]+646),峰12為次烏頭堿([M+H]+m/z616),峰11為中烏頭堿([M+H]+m/z632),峰7為14-苯甲酰中烏頭原堿([M+H]+m/z590)、峰8為14-苯甲酰烏頭原堿([M+H]+m/z604)、峰9為14-苯甲酰次烏頭原堿([M+H]+m/z574)。其他化合物質(zhì)譜數(shù)據(jù)依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行質(zhì)譜峰指認(rèn)。2.3.2不同配比白合煎液中不同離子峰峰面積煎煮液BPC圖見(jiàn)圖1,比較了制川烏單煎、制川烏與白蘞合煎(1∶0、1∶1、1∶3)的煎煮液BPC圖的差異。圖1顯示,單煎(1∶0)與合煎的煎煮液相比,合煎液(1∶1)中14-苯甲酰烏頭原堿和14-苯甲酰次烏頭原堿峰面積值較低,其他峰無(wú)明顯差異;隨著白蘞的比例增加,合煎液(1∶3)中14-苯甲酰烏頭原堿、14-苯甲酰次烏頭原堿以及14-苯甲酰中烏頭原堿峰面積比單煎液中(1∶0)明顯減少,其他離子峰峰面積也略有減小。沉積物BPC圖見(jiàn)圖2,比較了制川烏單煎(1∶0)、制川烏與白蘞合煎(1∶1、1∶3)沉積物的BPC圖的差異。圖2顯示,合煎(1∶3)與單煎(1∶0)的沉積物相比,14-苯甲酰-10-OH-中烏頭原堿、14-苯甲酰烏頭原堿和次烏頭堿離子峰峰面積有較顯著的增加,14-苯甲酰烏頭原堿和14-苯甲酰次烏頭原堿離子峰峰面積也略有增加,但其差異不顯著。2.3.3不同白配伍比例對(duì)沉積物中原則化合物量的影響由圖4可知,煎煮液中多數(shù)雙酯型、單酯型、醇胺型生物堿的量隨著白蘞的配伍比例增加呈現(xiàn)下降趨勢(shì),如10-OH-烏頭堿、10-OH-中烏頭堿、10-OH-苯甲酰烏頭原堿、14-苯甲酰-10-OH-中烏頭原堿、烏頭原堿、中烏頭原堿等化合物的量均隨著白蘞配伍比例的增加(1∶0、1∶0.25、1∶0.5)而逐漸降低,而在沉積物中多數(shù)生物堿的量隨白蘞比例增加上呈上升趨勢(shì)。2.4重復(fù)性與穩(wěn)定性考察精密稱取0.2g的白蘞粉末(過(guò)5號(hào)篩),加入80%硝酸鈣溶液至10mL;分別加入2mL0.5%碘液,混勻,靜置,3500r/min離心15min,棄去上清,沉淀用5%的含碘硝酸鈣溶液洗滌2次,離心棄去上清;在沉淀中加入8mL0.1mol/LNaOH混勻,沸水浴5min,使沉淀溶解。冷卻后,25mL量瓶定容,加入0.3mL0.5%碘液和1mol/L鹽酸5mL,在581nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以純淀粉作為對(duì)照,計(jì)算白蘞中淀粉類成分的量。按照上述方法平行制備6份供試品溶液,依次測(cè)定分析其重復(fù)性;且其中1份連續(xù)測(cè)定6次分析其精密度;分別在0、2、4、8、12、24h測(cè)定,分析其穩(wěn)定性;平行制備3份供試品溶液加入等量的純淀粉對(duì)照品考察加樣回收率,結(jié)果其精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性RSD均小于2%,表明該儀器精密度良好,樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定,方法重復(fù)性良好,加樣回收率達(dá)97.99%,RSD為0.19%。以純淀粉為對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=8.6737X-0.0205,r=0.9988,線性范圍為0.02~0.4mg/mL,計(jì)算可知0.2g白蘞中淀粉濃度為0.2043mg/mL,質(zhì)量為50.88mg,占白蘞生藥總量的25.44%。2.5重復(fù)性和穩(wěn)定性精密稱定白蘞1.8g,加水150mL,放置過(guò)夜,超聲10min,加水100mL,搖勻,靜置,棄去初濾液50mL,精密量取續(xù)濾液20mL,置100mL棕色量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻。加入依照《中國(guó)藥典》2010年版方法配制的磷鉬鎢酸試液,取該試液1mL,再分別加水11.5、11、10、9、8、7mL,用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度,搖勻,放置30min,以相應(yīng)試劑為空白,在760nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以沒(méi)食子酸為對(duì)照品計(jì)算白蘞中鞣質(zhì)類成分的量。按照上述方法,平行操作6份供試品溶液,依次測(cè)定分析重復(fù)性;且其中1份連續(xù)測(cè)定6次分析儀器的精密度;分別在0、2、4、8、12、24h測(cè)定分析樣品穩(wěn)定性,計(jì)算其方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性RSD均<2%,表明該儀器精密度良好,樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定,重復(fù)性良好。以沒(méi)食子酸為對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=97.688X-0.0688,r=0.9997,線性范圍為2.5~25.0μg/mL,經(jīng)計(jì)算可得1.8g白蘞總酚量為42.9mg,不被吸附的多酚的量為37.3mg,鞣質(zhì)的量=總酚量-不可吸附的多酚量,為5.6mg,占白蘞總量的0.31%。3不同配比的中力學(xué)成分在不同的中藥動(dòng)物中的配伍毒性變化制川烏主要有效成分為劇毒的雙酯型生物堿,而且治療劑量與中毒劑量接近,主要包括烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等,經(jīng)過(guò)炮制或煎煮后水解成相應(yīng)的單酯型二萜生物堿如14-苯甲酰烏頭原堿、14-苯甲酰次烏頭原堿、14-苯甲酰中烏頭原堿、10-OH-苯甲酰烏頭原堿等,毒性大為降低,繼續(xù)水解生成醇胺型的生物堿如次烏頭原堿、烏頭原堿和中烏頭原堿等,幾乎沒(méi)有毒性。所以本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)制川烏的關(guān)鍵藥效成分進(jìn)行分析。本研究采用與臨床用藥一致的煎煮法,并將制川烏先煎,旨在對(duì)制川烏進(jìn)行更深入的研究以及實(shí)現(xiàn)制川烏臨床使用的安全有效提供一定的理論參考。通過(guò)對(duì)川烏與半夏、瓜蔞、貝母、白蘞等配伍雙酯型生物堿變化的影響因素進(jìn)行研究,其結(jié)果顯示可能是由于煎煮過(guò)程pH值的變化導(dǎo)致的。但是關(guān)于配伍前后煎煮液中生物堿類成分變化規(guī)律的研究較少。在本課題前期對(duì)白蘞和制川烏配伍毒性變化的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn),白蘞與制川烏的配伍在1∶0.2~1∶5時(shí),毒性有顯著的變化,因此本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上選擇區(qū)間內(nèi)的配伍比例進(jìn)行分析,并對(duì)煎煮液和沉淀中的烏頭類生物堿的量都進(jìn)行了測(cè)定(半定量),發(fā)現(xiàn)隨著白蘞配伍比例的增加烏頭類生物堿的量在煎煮液中呈降低趨勢(shì),而在沉淀中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。白蘞的主要成分為淀粉、有機(jī)酚酸類和黃酮類等多羥基物質(zhì)。酸性成分可能在煎煮過(guò)程中與生物堿類成分發(fā)生作用,對(duì)生物堿的溶出及量產(chǎn)生影響。在復(fù)方湯劑煎煮過(guò)程中,淀粉類成分在高溫水溶液中分散并吸水溶脹,具有一定的黏性,而小分子物質(zhì)與溶脹淀粉混合成均勻糊狀溶液,使其在水溶液中的溶出度受到影響。較高濃度的鞣質(zhì)類成分在水中形成的膠體具有黏性,亦可能影響小分子物質(zhì)的溶出。此外,淀粉的組成和性質(zhì)影響中藥湯劑的理化性質(zhì),進(jìn)而對(duì)湯劑療效產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)白蘞中鞣質(zhì)和淀粉的量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明,白蘞中鞣質(zhì)的量很低,僅為0.31%,而淀粉的量高達(dá)25%以上,實(shí)驗(yàn)中制川烏煎煮液中生物堿成分的量隨白蘞的配比增加而有降低的趨勢(shì),可能是由于白蘞中大量淀粉對(duì)生物堿的溶出產(chǎn)生影響,其變化的機(jī)制需要進(jìn)一步探索。4線性質(zhì)譜檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)初步分析了不同量的白蘞與制川烏配伍煎煮后特征化學(xué)成分的變化規(guī)律,并對(duì)其變化機(jī)制進(jìn)行初步的推測(cè)和分析,研究證實(shí)白蘞能夠顯著地影響制川烏中生物堿類成分在煎煮液和沉淀中的量,由于生物堿類成分是制川烏中的藥效成分也是其毒性成分,生物堿量的變化影響其藥效和毒性,因此白蘞通過(guò)對(duì)生物堿量的影響在配伍過(guò)程中對(duì)制川烏的作用產(chǎn)生影響,起到相反的作用,其變化的規(guī)律為“十八反”配伍化學(xué)機(jī)制的研究提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。Agilent1200/API4000型RRLC/Q-TOF-MS/MS色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、MassLynxV4.1質(zhì)譜工作站(Agilent公司),HeraeusLabofuge400R冷凍離心機(jī)(ThermoScientific),UV2100紫外分光光度計(jì)(北京譜朋科技有限公司)。制川烏的活性成分也是其毒性成分,主要為生物堿類。雙酯型生物堿如烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿等,其水解后生成相應(yīng)的單酯型和醇胺型生物堿,較雙酯型生物堿毒性大幅降低但仍具有一定活性。本實(shí)驗(yàn)著重關(guān)注這些生物堿類成分并通過(guò)對(duì)照品比對(duì)和質(zhì)譜信息鑒定了其中13種生物堿。為了更加準(zhǔn)確、直觀地闡明煎煮液和沉積物中不同比例配伍的制川烏與白蘞間差異性,本研究所得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)ProfileAnalysis軟件處理后,將數(shù)據(jù)導(dǎo)入S