獼猴桃小腸血管活性腸肽的分布及受體的表達(dá)

20世紀(jì)70年代，sutt從豬的腸道中分離出具有強(qiáng)烈伸展效果的活性物質(zhì)，即血管活性物質(zhì)（vip）。VIP是腸神經(jīng)系統(tǒng)(entericnervoussystem,ENS)中最具有代表性的神經(jīng)肽之一,廣泛分布于全身各個(gè)系統(tǒng),是一種具有多種生物學(xué)活性的重要胃腸多肽。免疫組織化學(xué)研究表明,VIP分布于整個(gè)ENS,存在于許多動(dòng)物的胃、小腸、大腸的肌間神經(jīng)叢和黏膜下層神經(jīng)叢,VIP神經(jīng)元是ENS中主要的抑制性神經(jīng)元。小腸在胚胎期是一簡單的直管,在發(fā)育過程中經(jīng)歷了長度增加、彎曲、腸袢形成、扭轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)、盤曲等過程。ENS在出生后發(fā)育加速。在發(fā)育過程中,作為ENS的重要遞質(zhì),腸內(nèi)VIP的含量演變規(guī)律并不清楚。VIP對(duì)腸道動(dòng)力、血液供給、水與電解質(zhì)的分泌、腸黏膜免疫具有重要的調(diào)節(jié)功能。探討發(fā)育過程中小腸、肝臟VIP的產(chǎn)生經(jīng)歷了怎樣的演變過程,有助于理解消化系統(tǒng)的發(fā)育、衰老及腫瘤的發(fā)生。我們曾在大鼠的實(shí)驗(yàn)中觀察到,從胚胎到幼年肝臟VIP含量逐漸增加,但成年大鼠肝臟VIP含量卻明顯下降,VIP受體1型(VIPreceptor1,VIPR1)的含量在出生前后也有類似的變化規(guī)律。以往研究認(rèn)為,肝細(xì)胞上VIPR與VIP結(jié)合后使VIP迅速降解,因此外周血中VIP含量極低。按此推測,成年肝臟中應(yīng)有大量VIPR才能滿足對(duì)出生后增長的VIP降解的需求,但實(shí)際檢測的情況卻并非如此。此外,大鼠與靈長類在種屬上有較大差別。本文觀察了胚胎、新生和成年獼猴小腸、肝臟VIP及其受體含量及分布的變化。1材料和方法1.1年齡及胎齡及胎齡4只健康獼猴來自成都野生動(dòng)物世界,檢疫均為合格,年齡分別為胚胎6月、新生2d、新生45d及成年,胎齡根據(jù)孕猴末次月經(jīng)推算。研究人員獲得四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證書。1.2血樣的采集和處理給獼猴皮下注射鹿眠寧(二甲苯胺噻唑和鹽酸二氫埃托啡經(jīng)優(yōu)選配比組成的復(fù)方化學(xué)保定劑)20～35μL/kg麻醉,股靜脈穿刺抽血5mL,無菌手術(shù)鋪巾,剖開腹腔,抽取門靜脈血3mL,分別取回腸末端組織(距回腸末端2～3cm)和肝右葉組織。將所采集的全血(外周血和門靜脈血)分別注入含10%EDTA-Na260μL、抑肽酶3000kIU的預(yù)冷玻璃管中,混勻后立即2500r/min離心15min,分別取血漿0.5mL/管、1.0mL/管,-20℃保存。組織標(biāo)本一部分用石蠟包埋、切片,另一部分快速凍存于-80℃。孕猴行剖宮術(shù)取出胎猴,處理方法同上。血漿標(biāo)本準(zhǔn)備、小腸及肝臟組織勻漿制備、組織樣本蛋白質(zhì)定量測定等具體操作參考我們已報(bào)道的方法。1.3檢測結(jié)果的計(jì)算按VIP放射免疫試劑盒(海軍放射免疫技術(shù)中心,北京)操作說明進(jìn)行,放射免疫檢測分析儀(SN-695B型,智能放射免疫計(jì)數(shù)儀,上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算和打印檢測結(jié)果。每個(gè)年齡段的回腸、肝臟、門靜脈和外周血標(biāo)本各取3份,每份測2次。1.4抗菌藥的制備制作不同發(fā)育階段獼猴小腸和肝臟組織石蠟切片,于60℃烤箱烘烤2h或過夜。脫蠟,微波抗原修復(fù)15min和酶消化(37℃)20min,10%正常山羊血清封閉,室溫孵育20min。滴加兔抗人多克隆VIP抗體工作液(Zymed公司,美國)。37℃孵育120min后4℃過夜。按鏈霉卵白素-過氧化氫酶免疫組化試劑盒(Zymed公司,美國)說明書完成免疫染色各步驟,DAB(SantaCruz公司,美國)顯色、封片。1.5胃蛋白酶處理制作不同發(fā)育階段獼猴小腸和肝臟組織石蠟切片,脫蠟,20%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶,加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶,用含DEPC的1%多聚甲醛浸泡。加預(yù)雜交液,蓋原位雜交專用蓋玻片,37℃恒溫箱孵育4h。加雜交液,在37℃用SSC洗滌,加封閉液,依次滴加生物素化鼠抗地高辛及生物素化過氧化酶(博士德生物工程有限公司,武漢),DAB顯色、蘇木素復(fù)染、中性樹膠封片。1.6hpv含量測定數(shù)據(jù)用mean±SD表示。所測組織標(biāo)本中VIP含量以ng/mg蛋白表示。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件方差分析,P<0.05為有顯著性差異。2結(jié)果2.1不同年齡的對(duì)階段小鼠組織的hpv含量的影響隨著小腸的發(fā)育、成熟,小腸內(nèi)VIP含量逐漸增加,至成年期時(shí)達(dá)最高水平。而在肝臟組織,VIP含量變化趨勢恰好與小腸相反。在獼猴胚胎期,小腸組織的VIP含量僅較肝臟組織高約36%。但出生以后,小腸組織的VIP含量急劇增加,在新生2d時(shí),小腸組織的VIP為肝臟的16倍。進(jìn)入成年,肝組織中VIP含量顯著降低,僅為胚胎期的30%(P<0.01);但小腸組織中VIP較胚胎期升高25倍(P<0.01);小腸組織VIP含量遠(yuǎn)高于肝組織,約為其115倍(P<0.01)(表1)。不同年齡獼猴門靜脈的VIP含量均高于外周血水平。值得注意的是,成年期獼猴門靜脈VIP含量較外周血高出18倍(P<0.01),其差值遠(yuǎn)高于胚胎和新生期(表1)。2.2僅有規(guī)律分布的陽性點(diǎn),可能引起重或輕、輕胚胎6月時(shí),在獼猴小腸絨毛根部及黏膜下層可見少量的VIP陽性染色顆粒,新生2d時(shí)這些變化不大,但新生45d時(shí)隨著小腸絨毛的增加,黏膜下層VIP陽性染色顆粒增加,可見增大的、不規(guī)則的、VIP陽性染色極為濃集的結(jié)構(gòu),絨毛隱窩部的VIP陽性染色顆粒也增加,在環(huán)行肌層可見少量散在的陽性VIP染色顆粒。當(dāng)發(fā)育進(jìn)入成年,黏膜下層神經(jīng)可見極為濃集的明顯的VIP陽性染色,小腸絨毛隱窩部的VIP染色明顯增加,呈濃集的星狀顆粒樣分布。在環(huán)、縱行肌間神經(jīng)叢及環(huán)行肌,也可見到散在的或聚集成環(huán)狀的VIP顆粒(圖1)。胚胎6月和新生2d,獼猴肝臟內(nèi)可見散在無規(guī)律分布的陽性VIP染色顆粒。新生45d后至成年,肝臟內(nèi)難以見到陽性VIP染色(圖2)。2.3其他相關(guān)的傳統(tǒng)hpvr1表達(dá)從胚胎到成年小腸VIPR1的表達(dá)逐漸上調(diào)。在成年小腸VIPR1主要分布于絨毛隱窩部、黏膜下層神經(jīng)及環(huán)、縱行肌間神經(jīng)叢及環(huán)行肌。在胚胎及新生期,環(huán)、縱行肌尚未充分發(fā)育,難以見到VIPR1表達(dá)。進(jìn)入成年,環(huán)、縱行肌間神經(jīng)叢及環(huán)行肌可見大量VIPR1表達(dá),聚集成環(huán)狀(圖3)。胚胎6月,獼猴肝臟血管可見陽性VIPR1染色。出生以后至成年,肝臟血管VIPR1染色逐漸轉(zhuǎn)陰性(圖2)。3期肝臟正常生長和非膽堿能、no活動(dòng)中肝臟考慮的其他因素VIP是ENS的重要抑制性遞質(zhì)。以往的研究認(rèn)為,在人的回腸,VIP主要分布于黏膜下層和環(huán)形肌層,這些數(shù)據(jù)僅來自小腸分離的各部分檢測,缺乏整體形態(tài)學(xué)研究,更沒有從發(fā)育的角度認(rèn)識(shí)ENS。本實(shí)驗(yàn)首次觀察到,從胚胎到成年,獼猴小腸壁內(nèi)的VIP最初來自黏膜下層的神經(jīng),當(dāng)此處VIP神經(jīng)纖維由細(xì)增粗時(shí),VIP神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)逐漸擴(kuò)展至腸黏膜隱窩部,環(huán)、縱形肌間神經(jīng)叢及環(huán)行肌。從形態(tài)學(xué)觀察到放射免疫定量分析,小腸內(nèi)VIP含量隨著發(fā)育的成熟大量增加,反映了ENS是在出生以后才得以迅速發(fā)育的。以往一直認(rèn)為,釋放入黏膜或肌層內(nèi)的VIP進(jìn)入門靜脈血循環(huán)后主要是在肝臟與肝細(xì)胞上的VIPR結(jié)合而被降解、滅活。所以,血漿VIP水平很低。本實(shí)驗(yàn)中,在胚胎6月,獼猴肝細(xì)胞沒有表達(dá)VIPR1,此時(shí)小腸VIP含量僅較肝臟高約36%,門靜脈和外周血VIP含量也無顯著差別,提示此階段小腸VIP并不經(jīng)肝臟代謝。出生后到成年,肝細(xì)胞上仍未見VIPR1表達(dá),但成年小腸VIP含量為肝臟的115倍,可以認(rèn)為來自小腸的VIP進(jìn)入門靜脈后,很快被血循環(huán)中的中性內(nèi)肽酶降解,VIP并不在肝臟被降解和代謝。胚胎6月,獼猴肝臟血管可見陽性VIPR1染色,由于VIPR在胚胎血管發(fā)生中起著重要作用,因此胚胎期獼猴肝臟血管的VIPR1與肝血管床的發(fā)育密切相關(guān)。出生以后至成年,肝臟血管VIPR1染色逐漸轉(zhuǎn)陰性,肝臟的體積也漸趨穩(wěn)定。VIPR在干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞的早期即可出現(xiàn),此外,腸上皮的VIPR也存在于因基因表達(dá)程序不同而導(dǎo)致的不同細(xì)胞表型中,如腸細(xì)胞和分泌黏液的杯狀細(xì)胞,這與VIP對(duì)不同分化表型細(xì)胞株的水電解質(zhì)和黏液分泌中的雙重調(diào)節(jié)作用相一致。腸細(xì)胞富含VIPR,目前認(rèn)為VIP對(duì)腸細(xì)胞可能有直接作用。在胚胎和新生期,僅在小腸絨毛上皮層有少量的VIP,黏膜隱窩處未見VIP分布。而此時(shí)小腸上皮普遍表達(dá)VIPR1,因此VIPR1可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞生長。最近研究表明,VIP也有促生長作用,可促進(jìn)胚胎結(jié)、直腸的發(fā)育。但是在這一發(fā)育階段,由于VIP的含量并不高,更因?yàn)闆]有食物的刺激,小腸絨毛發(fā)育比較慢。VIP能促進(jìn)水與電解質(zhì)的分泌,主要是通過腸絨毛上皮頂端的Cl-門控通道刺激Cl-分泌,對(duì)側(cè)基底膜的K+,Na+/Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)也有促進(jìn)作用。我們觀察到,從胚胎到成年小腸VIPR1的表達(dá)逐漸上調(diào),在成年小腸主要分布于絨毛隱窩部、黏膜下層神經(jīng)及環(huán)、縱行肌間神經(jīng)叢及環(huán)行肌。在成年腸黏膜上皮內(nèi)VIPR1分布較多,同時(shí)伴有小腸絨毛發(fā)育的成熟。VIP陽性神經(jīng)元主要位于小腸絨毛的隱窩部,而VIPR1則散在分布于整個(gè)小腸絨毛,說明從VIP陽性神經(jīng)元釋放出的VIP并不僅在一個(gè)很小的局部范圍內(nèi)發(fā)揮作用,它至少可從絨毛的隱窩部彌散到絨毛的頂端。VIP和NO是非膽堿能、非腎上腺能神經(jīng)遞質(zhì),VIP對(duì)消化道運(yùn)動(dòng)起抑制性調(diào)節(jié)作用,其調(diào)節(jié)途徑有NO相關(guān)性和NO非相關(guān)性(即cAMP依賴的蛋白激酶途徑)兩種。VIP作用于胃腸道平滑肌細(xì)胞表面的特異性受體,通過結(jié)合Gs蛋白激酶激活腺苷環(huán)化酶,使細(xì)胞內(nèi)cA