低雙乙?？共《酒【平湍腹こ叹臉?gòu)建及發(fā)酵特性研究

雙丁是啤酒中的主要口感材料，啤酒的限制很低。如果雙丁的濃度超過(guò)規(guī)定的閾值，則會(huì)產(chǎn)生不愉快的味道。雙乙酰是由酵母菌異亮氨酸_纈氨酸生物合成途徑中的中間產(chǎn)物α_乙酰乳酸滲透到胞外經(jīng)非酶促氧化脫羧反應(yīng)生成的。一般在啤酒發(fā)酵后期還原雙乙酰需要約5～10d的時(shí)間,因而雙乙酰的形成與消除是啤酒風(fēng)味成熟的重要限速步驟。隨著對(duì)酵母形成雙乙酰機(jī)理及其分子遺傳學(xué)的逐漸了解,通過(guò)基因工程的手段修飾異亮氨酸_纈氨酸生物合成途徑,從而降低雙乙酰的形成成為可能。ILV2基因編碼的α_乙酰乳酸合成酶活性與雙乙酰前體α_乙酰乳酸的含量水平密切相關(guān)。γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)所編碼的γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶是谷胱甘肽合成途徑中的限速步驟,增強(qiáng)γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性可以增加谷胱甘肽的形成量,可以提高啤酒的抗老化能力。重組DNA技術(shù)的飛速發(fā)展為通過(guò)基因工程技術(shù)改良工業(yè)酵母菌提供了極大的便利。在酵母菌遺傳修飾中,根據(jù)是否引入外源基因,重組菌株被分為自克隆和非自克隆菌株。自克隆菌株中不含有任何外源DNA片段,因此是生物安全的。本文通過(guò)自克隆技術(shù)構(gòu)建了低雙乙酰抗老化的啤酒酵母工程菌,并對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1酵母菌u2004大腸桿菌DH5α[supE44ΔlacU169(Ψ80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi_1relA1]用于質(zhì)粒的構(gòu)建。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YS58(MATαflo1leu2_3,112his4_519trp1_719ura3_52)由本實(shí)驗(yàn)室保存。啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YSF31由青島啤酒集團(tuán)提供。質(zhì)粒YEp352(ampRURA3)是大腸桿菌/酵母菌穿梭載體。質(zhì)粒BluescriptM13_、含有ILV2基因的質(zhì)粒pLZ_2和含有GSH1的質(zhì)粒pGF_2均由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2培養(yǎng)基的制備LB培養(yǎng)基按常規(guī)配制,使用前根據(jù)需要加入50μg/mL氨芐青霉素。培養(yǎng)酵母菌用YEPD培養(yǎng)基和YNB培養(yǎng)基按常規(guī)配制。限制酶、T4DNA連接酶,PfuDNA聚合酶均購(gòu)自華美公司。1.3dns操作大腸桿菌轉(zhuǎn)化按氯化鈣法進(jìn)行。啤酒酵母總DNA的提取及啤酒酵母的遺傳轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。1.4保健體pcr擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的CUP1基因序列設(shè)計(jì)引物:P1,5′_CCAAGATCTCGCTATACGTGCATATGTTC_3′和P2,5′_CGAGTCGACATCTGTTGTACTATCCGCTT_3′,劃線部分為BglⅡ和SalⅠ的識(shí)別位點(diǎn)。以YSF31的總DNA為模板,進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃變性40s,56℃退火1min,72℃延伸2min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸15min。1.5i-對(duì)丙烯酸合成酶ahas活性的測(cè)定α_乙酰乳酸合成酶活性的測(cè)定采用細(xì)胞通透測(cè)定法。1.6yepd培養(yǎng)條件將待測(cè)菌在YEPD斜面上活化,然后轉(zhuǎn)到5mLYEPD培養(yǎng)基中(沒(méi)有選擇壓力),28℃培養(yǎng),每24h轉(zhuǎn)接1次,共轉(zhuǎn)接5次后,取菌液涂布YEPD平皿,28℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。分別挑取100個(gè)單菌落于無(wú)菌水中,饑餓4h后,分別接種在YEPD及含4mmol/LCuSO4的YEPD培養(yǎng)基平皿上,28℃培養(yǎng)48h,測(cè)定單菌落對(duì)硫酸銅的抗性。1.7小型試驗(yàn)和試驗(yàn)中的發(fā)酵試驗(yàn)1.7.1麥芽汁培養(yǎng)法將酵母菌接入5mL麥芽汁培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)12h,以10%的接種量接種于10mL麥芽汁培養(yǎng)基,25℃培養(yǎng)36h,培養(yǎng)液全部接于270mL麥芽汁中,9℃靜置培養(yǎng)10d。1.7.2大三角瓶培養(yǎng)法前期培養(yǎng)同上,在270mL麥芽汁中,25℃培養(yǎng)36h,然后將培養(yǎng)液接入2000mL大三角瓶,20℃培養(yǎng)36h,接至100L發(fā)酵罐中。啟發(fā)后10℃培養(yǎng),當(dāng)糖度降到2.6時(shí),降溫到0℃后儲(chǔ)存。1.8發(fā)酵性能的測(cè)定細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量測(cè)定按文獻(xiàn)進(jìn)行。其他發(fā)酵指標(biāo)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。雙乙酰的測(cè)定方法采用蒸餾法和氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定。2結(jié)果2.1質(zhì)粒及轉(zhuǎn)化子的篩選以YSF31的總DNA為模板,PCR擴(kuò)增出大小1.1kb的CUP1基因。PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒BluescriptM13_的HincⅡ位點(diǎn),得到質(zhì)粒pMCUP。用KpnⅠ和SalⅠ酶切質(zhì)粒pMCUP,將得到的CUP1插入到穿梭載體YEp352中,構(gòu)成質(zhì)粒pYCUP。用pYCUP轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室酵母菌株YS58,在含有Leu、His和Trp的YNB培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。銅抗性測(cè)定結(jié)果表明在含有3mmol/LCuSO4的YEPD中,YS58與轉(zhuǎn)化子都能生長(zhǎng);而在5～9mmol/LCuSO4的YEPD中,只有轉(zhuǎn)化子能夠生長(zhǎng),YS58不能生長(zhǎng)。可見(jiàn)PCR擴(kuò)增到的CUP1基因能夠在酵母菌中表達(dá),使細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)硫酸銅的抗性,可以用作酵母轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。2.2通過(guò)重組顆粒的形成和細(xì)菌的轉(zhuǎn)化2.2.1重組質(zhì)粒pggf2的表達(dá)用BglⅡ和SalⅠ酶切質(zhì)粒pYCUP得到CUP1基因,用SalⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pGF_2得到GSH1,上述兩基因插入到質(zhì)粒pLZ_2的BglⅡ和XbaⅠ位點(diǎn),獲得質(zhì)粒pICG(圖1)。酶切分析表明重組質(zhì)粒pICG構(gòu)建正確(圖2)。該重組質(zhì)粒中ILV2基因內(nèi)部約2.3kb的DNA片段被CUP1和GSH1替換。2.2.2u2004片段與基因gsh1同源重組—酵母菌的轉(zhuǎn)化:用KpnⅠ和PstⅠ酶切重組質(zhì)粒pICG得到一個(gè)6.0kb大小的DNA片段。此片段含有銅抗性基因CUP1和γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1,兩端含有ILV2基因的5′端和3′端序列。用此DNA片段轉(zhuǎn)化啤酒酵母YSF31,使該片段與染色體在ILV2位點(diǎn)發(fā)生同源重組(圖3)。通過(guò)細(xì)胞對(duì)硫酸銅的抗性篩選到轉(zhuǎn)化子。2.3轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證2.3.1pcr檢測(cè)capttcgtct和美國(guó)fig、實(shí)際轉(zhuǎn)化子的表達(dá)以受體和轉(zhuǎn)化子的總DNA為模板,用引物ILV2_1(5′_GCAGGATCCTGGCTTCAGTTGCTGTCT_3′)和CUP1的引物P2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果在受體中沒(méi)有擴(kuò)增出任何DNA片段,而在挑選的3個(gè)轉(zhuǎn)化子中,都擴(kuò)增出了大小為1.3kb的DNA片段(圖4)。說(shuō)明在轉(zhuǎn)化子的染色體上,銅抗性基因和γ_谷氨酰半胱氨酸合成酶基因已經(jīng)插入到了ILV2基因內(nèi)部。2.3.2ilv2基因?qū)has酶活性的影響AHAS酶活測(cè)定結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)化子中AHAS的酶活性明顯降低,只有受體的50%(表1)?？梢?jiàn)轉(zhuǎn)化子中部分ILV2基因被破壞。相應(yīng)轉(zhuǎn)化子被命名為T2。2.4yepd和wolbachis3.按方法中1.6一節(jié)所述,分別挑選YSF31、T2的單菌落各100個(gè),在無(wú)菌水饑餓后分別接種在不同的培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)48h后檢測(cè)生長(zhǎng)情況。受體菌YSF31的100個(gè)單菌落在YEPD培養(yǎng)基上全部生長(zhǎng),而在含有4mmol/LCuSO4的YEPD培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)。啤酒酵母工程菌T2的100個(gè)單菌落在YEPD培養(yǎng)基和含4mmol/LCuSO4的YEPD培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)。結(jié)果表明啤酒酵母工程菌具有很強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性。2.5葡萄糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)2.5.1谷胱甘肽工程菌株的gsh1和ilv2基因?qū)﹄p乙酰合成的影響按材料和方法中所述進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn),每?jī)商烊訖z測(cè),發(fā)現(xiàn)第6天啤酒酵母工程菌T2的谷胱甘肽含量峰值比受體YSF31的高34%,而啤酒酵母工程菌發(fā)酵液中的雙乙酰含量比受體的低,啤酒酵母工程菌株T2雙乙酰的峰值是受體的75%(圖5)。可見(jiàn)GSH1基因拷貝數(shù)的增加使谷胱甘肽合成提高;而ILV2基因的破壞,使AHAS酶活性明顯降低,導(dǎo)致雙乙酰合成的減少。轉(zhuǎn)化子的其他發(fā)酵指標(biāo)如絮凝性、α-N氨基酸同化率、真正發(fā)酵度等與受體基本相同(表2)。由CO2減重實(shí)驗(yàn)和真正發(fā)酵度的檢測(cè)結(jié)果可以看出,啤酒酵母工程菌的發(fā)酵速度和發(fā)酵度基本沒(méi)有發(fā)生改變,說(shuō)明基因ILV2的敲除沒(méi)有影響酵母的繁殖速度。2.5.2啤酒的抗氧化能力分析按方法所述在青島啤酒集團(tuán)進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn)。用蒸餾法進(jìn)行雙乙酰測(cè)定,當(dāng)雙乙酰含量降到0.5mg/L時(shí),降溫到0℃進(jìn)入后發(fā)酵期,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明啤酒酵母工程菌比YSF31提前3d進(jìn)入后發(fā)酵期。用代巴比妥酸(TBA)測(cè)定羰基化合物法檢測(cè)啤酒的抗老化能力,結(jié)果表明啤酒酵母工程菌的抗老化能力是受體菌的1.5倍。其中啤酒酵母工程菌的TBA值為225.60,而受體菌的TBA值為151.82。各種風(fēng)味物質(zhì)在發(fā)酵后期用高壓氣相色譜進(jìn)行了測(cè)定,啤酒酵母工程菌與受體菌沒(méi)有明顯區(qū)別(表3)。經(jīng)過(guò)陳化以后,經(jīng)專家品評(píng),一致認(rèn)為啤酒酵母工程菌所產(chǎn)啤酒風(fēng)味優(yōu)于受體菌。3啤酒酵母工程菌的gsh特性在釀酒酵母中α-乙酰乳酸合成酶(AHAS)催化雙乙酰前體α-乙酰乳酸的合成。在啤酒酵母的染色體上,有兩個(gè)編碼AHAS的等位基因,一個(gè)與釀酒酵母同源,另一個(gè)與卡爾斯伯酵母同源。本研究通過(guò)同源重組使青島啤酒酵母染色體上與釀酒酵母同源的等位基因ILV2內(nèi)部DNA片段被CUP1基因和GSH1基因所取代,獲得AHAS酶活力明顯降低的啤酒酵母工程菌。在發(fā)酵過(guò)程中雙乙酰合成量的減少,不但改進(jìn)了啤酒風(fēng)味而且縮短了發(fā)酵周期。同時(shí)在ILV2基因內(nèi)部插入的GSH1基因,導(dǎo)致啤酒酵母工程菌的GSH含量增加。由于GSH是水溶性的小分子多肽,在啤酒發(fā)酵期間,酵母細(xì)胞生成的部分GSH能分泌到發(fā)酵液,加之在發(fā)酵后期,部分酵母細(xì)胞發(fā)生自溶,這也能使部分GSH釋放到發(fā)酵液中,因此在成品啤酒中的GSH含量也就相應(yīng)增加,能使成品酒的保鮮時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)。啤酒是一種成分復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)品,其獨(dú)特的風(fēng)味特征是由其中的各種化合物之間保持微妙的平衡所賦予的,任何一種物質(zhì)過(guò)多或過(guò)少,都有可能打破這種平衡,影