固定化法固定化啤酒酵母泥固定化蔗糖酶的實(shí)驗(yàn)研究

作為一種生物催化劑，該酶廣泛應(yīng)用于食品、藥物、化工等行業(yè)。但由于其制備工藝繁瑣,回收率偏低;使用過(guò)程中極易受溫度、pH值和無(wú)機(jī)離子等外界因素的影響變性失活等因素,使其在工業(yè)上的應(yīng)用受到了很大的限制。酶的固定化是將水溶性酶用物理或化學(xué)方法處理,使之成為不溶于水但仍具有酶活力的酶的衍生物,從而防止酶的失活或水解,以此延長(zhǎng)酶的使用時(shí)間。該技術(shù)的出現(xiàn)為上述問(wèn)題的解決提供了可能。目前常用的酶的固定化方法有:物理吸附法、載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法。本文主要研究包埋法固定啤酒酵母蔗糖酶對(duì)酶活力影響,并對(duì)固定化前后溫度、pH值對(duì)酵母蔗糖酶的影響進(jìn)行一些探討。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑1.1.1實(shí)驗(yàn)材料青島啤酒溫江分廠廢棄的啤酒酵母泥(過(guò)濾后用蒸餾水洗4遍)1.1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備恒溫水浴鍋電爐漏斗止血夾移液管燒杯25mL血糖管試管751分光光度計(jì)。1.1.3試劑的配制蒸餾水海藻酸鈉4%氯化鈣溶液10%蔗糖溶液0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液3,5二硝基水楊酸試劑pH4.0pH5.0的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH6.0pH7.0pH8.0的0.2mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1冷卻、冷卻稱0.5g的海藻酸鈉加入50mL蒸餾水中,微火加熱溶解后冷卻到300℃左右,將1g的酵母液加入混勻。然后倒入下邊裝有膠管與止血夾的漏斗中,讓其慢慢滴入4%氯化鈣溶液中,制成直徑2mL-3mL的球形固定化酵母。1.2.2基水楊酸試劑取7支編號(hào)的試管按表1的順序加入0.1%GIc,水及3,5二硝基水楊酸試劑。然后在沸水浴中加熱5min,立即用自來(lái)水冷卻,轉(zhuǎn)移至血糖管中并用蒸餾水定容至25mL搖勻,于540nm測(cè)光密度,以葡萄糖540nmmg數(shù)為橫坐標(biāo),光吸收值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3酵母液的用量將固定化的酵母細(xì)胞加入20mL10%的蔗糖溶液浸泡10min,取0.5mL水解液按表2測(cè)定。稱1g的酵母液加入20mL10%的蔗糖溶液浸泡10min,過(guò)濾后取上清液0.5mL按表2測(cè)定?？瞻滓?0%的蔗糖液做對(duì)照。在常溫(25℃)下反應(yīng),在540nm下測(cè)定吸光度。1.2.4蔗糖對(duì)酵母細(xì)胞活性的影響分別稱取1g固定前的酵母細(xì)胞于5支試管中,將固定化的酵母細(xì)胞準(zhǔn)確分成5份放于另5支試管中,再分別加入4mL10%的蔗糖溶液,在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反應(yīng)10min后,取水解液按表3測(cè)定酶活性。1.2.5蔗糖對(duì)土壤酶活性的影響分別稱取1g固定前的酵母細(xì)胞于5支試管中,將固定化的酵母細(xì)胞準(zhǔn)確分成5份放于另5支試管中,再分別加入1.5mLpH4、pH5、pH6、pH7、pH8的緩沖溶液平衡5min,再分別加入4mL10%的蔗糖溶液反應(yīng)10min后,取水解液按表4測(cè)定酶活性。1.2.5葡萄糖酶活性測(cè)定1.2.5.1.甘蔗酶活性單位的定義在本實(shí)驗(yàn)條件下,每分鐘釋放1μg分子還原糖的酶量為一個(gè)活性單位。1.2.5.葡萄糖酶活力計(jì)算在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到所測(cè)定光密度值對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量,按下面公式計(jì)算酶活力:[E]=葡萄糖mg數(shù)×(4.5/0.5×10)×E的稀釋倍數(shù)2結(jié)果與討論2.1還原糖對(duì)還原糖活性的影響將等量固定、未固定的酵母細(xì)胞分別置于試管中,并加入4mL10%的蔗糖溶液,35℃水浴中保溫10min,然后按照文獻(xiàn)3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法測(cè)定酶活力(表5)。從計(jì)算結(jié)果可以看出固定前后酶活力變化不大。2.2溫度對(duì)還原糖酶活力的影響將1g未固定的酵母細(xì)胞置于5支試管中,再分別加入4ml10%的蔗糖溶液,不同溫度水浴中保溫10min,再按3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法測(cè)定酶活力(圖1)。結(jié)果表明溫度對(duì)酶的作用具有雙重影響:在較低的溫度范圍內(nèi),酶反應(yīng)速度隨溫度升高而增大,但是超過(guò)一定溫度后,反應(yīng)速度反而下降。由圖可知:固定前后此酶的最適溫度均為60℃。2.3,5-二苯基水楊酸還原糖對(duì)還原糖酶活力的影響將1g未固定的酵母細(xì)胞置于5支試管中,再分別加入4mL10%的蔗糖溶液,不同溫度水浴中保溫10min,再按3,5-二硝基水楊酸測(cè)定還原糖的方法測(cè)定酶活力(圖2)。結(jié)果表明固定前后此酶的最適pH值均接近于7。3.4固定化啤酒酵母泥的制備及保鮮效果通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知:啤酒酵母泥通過(guò)固定化后,對(duì)蔗糖酶活力影響不大。相反溫度、pH值對(duì)酶的活力影響較大,每種酶都有最適的溫度和pH值,該啤酒酵母泥的最適溫度是60℃,pH值是7.0。本實(shí)驗(yàn)主要是研究固定化前后對(duì)酶活力的影響以及最適的溫度和pH值。近年來(lái)關(guān)于固定化啤酒酵母泥的方法很多,從來(lái)就沒(méi)有停止過(guò),比如:用不溶于水的多糖