微生物活細(xì)胞在電化學(xué)生物傳感器上的快速響應(yīng)

微生物細(xì)胞的快速檢測是一個值得關(guān)注的問題。傳統(tǒng)的顯微鏡下微量池計數(shù)法致操作者疲倦,存在較大的主觀誤差,且不易區(qū)分活菌細(xì)胞與死菌細(xì)胞;平板接種培養(yǎng)后菌落計數(shù)法方法客觀、結(jié)果可靠,但需要恒溫培養(yǎng)至少24h以上方可獲得結(jié)果,因而無法滿足需要現(xiàn)場甚至是實時獲得檢測結(jié)果的場合,如發(fā)酵過程控制、鮮奶中雜菌總數(shù)測定等等。用于活菌總數(shù)檢測的生物傳感器已有報道,筆者在前人工作的基礎(chǔ)上,研制了一具電化學(xué)生物傳感器,可將微生物活細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)換為傳感器的電流輸出,并設(shè)計、研制了單片計算機控制、帶恒溫測量池的專用測定儀,研究了傳感器對大腸桿菌、啤酒酵母、霍亂弧菌及卡介菌苗的響應(yīng),實際測量了發(fā)酵罐中啤酒酵母菌總數(shù)及鮮牛奶中的細(xì)菌總數(shù),結(jié)果分別與顯微鏡下直接計數(shù)法及平板接種24h菌落計數(shù)法相吻合,但測量時間僅需數(shù)分鐘,基本做到了現(xiàn)場、實時的測定。1實驗和方法1.1試劑1.1.1磷酸緩沖溶液pbs磷酸二氫鉀(KH2PO4)和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)均為分析純,用去離子水配制成0.1M,pH=7.00的緩沖溶液。1.1.2電子增益手段1,6-二氯酚啶酚鈉鹽購自Fluka公司,用去離子水配成1%的溶液。1.1.3陰性溶液鐵氰化鉀(K[CN]4Fe)為分析純,用去離子水配成過飽和溶液。1.2菌株和鮮牛奶啤酒酵母細(xì)胞由桂林漓泉啤酒廠提供,大腸桿菌和霍亂弧菌由廣西區(qū)衛(wèi)生防疫站細(xì)菌科提供,卡介菌苗由桂林市結(jié)核病防治研究所提供,消毒鮮牛奶購自桂林市場。1.3溫度和測溫背景圖1是專用測定儀的原理框圖。恒溫測量池采用水浴式PID控溫,可在室溫加5℃至60℃設(shè)定測量池溫度T,控溫精度為±0.02℃;數(shù)字表頭采用四位半LED,電流測量范圍0.01～99.99μA;儀器可設(shè)定測量池攪拌速度Vr(10～300rpm)、電流采樣間隔時間t′(1～999s)和測量總時間Tt(1～9999s),可選擇“I-t”和“[dI/dt]-t”兩種測量方式。1.4單一晶圓片圖2是電化學(xué)生物傳感器的中縱剖圖。傳感器主體用直徑2.8cm有機玻璃棒車制;陽極系直徑2.2cm鉑片,貼于有機玻璃棒的一端;陰極為0.5cm×0.5cm×1.5cm的石墨條,置于充滿過飽和鐵氰化鉀溶液的陰極室內(nèi)。陰極室側(cè)面有一直徑3mm的小孔與外界通,此小孔用離子交換膜貼堵使陰極液不致外泄但可與陽極進(jìn)行離子交換。陽極和陰極均用細(xì)銀絲導(dǎo)出與測量儀的輸入端相接。1.5內(nèi)標(biāo)樣品的測量方式向測量池中加入磷酸緩沖溶液3.5ml,電子媒介溶液1.0ml,設(shè)定攪拌速度、溫度、電流采樣時間和測量總時間,選擇測量方式(I-t或[dI/dt]-t),按“測量”鍵讀出本底電流值,加入待測樣品溶液500μl,按“測量”鍵即可。2結(jié)果與討論2.1啤酒發(fā)酵原液對啤酒酵母的電流-時間i-t響應(yīng)曲線圖3是測量液中含與不含葡萄糖時大腸桿菌的I-t響應(yīng)曲線?？梢?測量液中含葡萄糖時,電流響應(yīng)大大增加。圖4是測量液中加與不加啤酒發(fā)酵原液時啤酒酵母的電流-時間(I-t)響應(yīng)曲線,可見,測量液中含啤酒發(fā)酵原液時,電流響應(yīng)大大增加。葡萄糖是許多細(xì)菌包括大腸桿菌的營養(yǎng)源,啤酒發(fā)酵原液是啤酒酵母的最佳培養(yǎng)基,實驗結(jié)果驗證了本傳感器是拾取微生物活細(xì)胞新陳代謝過程中電子轉(zhuǎn)移的原理,其電流值反映了微生物活細(xì)胞新陳代謝的程度,提示使用本傳感器系統(tǒng)可以進(jìn)行快速的菌種或培養(yǎng)基組分篩選。2.2不同微生物的電流加速度-時間響應(yīng)曲線[dI/dt]-t代表傳感頭輸出電流加速度與時間的關(guān)系,反映了微生物活細(xì)胞新陳代謝的速度。圖5是霍亂弧菌、啤酒酵母細(xì)胞、大腸桿菌和卡介苗的電流加速度-時間([dI/dt]-t)響應(yīng)曲線?？梢?霍亂弧菌在1min內(nèi)即達(dá)到響應(yīng)平臺并開始下降,啤酒酵母和大腸桿菌在10min內(nèi)達(dá)到響應(yīng)平臺并開始下降,而卡介苗則在60min后才達(dá)到響應(yīng)平臺并開始下降。結(jié)果說明:幾種微生物活細(xì)胞的電流加速度-時間([dI/dt]-t)響應(yīng)順序與這幾種微生物的新陳代謝速度順序是相吻合的。實驗結(jié)果提示本傳感器可用于微生物活細(xì)胞生長特性的快速評估。2.3兩種方法對于新鮮牛奶中雜菌總數(shù)的檢測效果分析啤酒發(fā)酵過程中尤其是發(fā)酵中后期,需要對發(fā)酵罐中的酵母活細(xì)胞濃度進(jìn)行定時測定,以確定終止發(fā)酵的最佳時間。啤酒廠現(xiàn)行的酵母活細(xì)胞數(shù)測定均采用臺盼藍(lán)染色后的顯微鏡下直接計數(shù)法,此法雖簡便易行,但操作人員的情緒波動和疲勞極易導(dǎo)致主觀誤差的產(chǎn)生。本實驗使用啤酒廠提供的標(biāo)準(zhǔn)啤酒酵母制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,在發(fā)酵車間現(xiàn)場測定了發(fā)酵罐中酵母細(xì)胞數(shù)12h的動態(tài)變化,其結(jié)果如圖6。結(jié)果表明傳感器法與顯微鏡下直接計數(shù)法測得的結(jié)果有高度的一致,但傳感器法可大大減輕檢驗人員的勞動強度,也避免了主觀因素導(dǎo)致的誤差。另從圖6可以看出,傳感器法測得值均偏低于顯微鏡下直接計數(shù)法的測得值,提示本傳感器僅對有生長活性的活菌響應(yīng),因而用傳感器法監(jiān)測發(fā)酵罐中活菌量較顯微鏡下直接計數(shù)法更有意義。隨著人民生活水平的提高,新鮮牛奶的消費越來越普及,而新鮮牛奶中微生物的污染也就受到人們越來越多的關(guān)注。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定特級生鮮牛奶中細(xì)菌總數(shù)不得超過5×105cells/ml,消毒鮮奶中細(xì)菌總數(shù)不得超過0.3×105cells/ml。由于平板培養(yǎng)菌落計數(shù)法需要培養(yǎng)24h才能獲得細(xì)菌總數(shù)的檢驗結(jié)果,許多中小型的奶場往往在細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果出來之前已將產(chǎn)品銷出,因而給人民健康帶來潛在的危害。為探討本傳感器用于新鮮牛奶中雜菌總數(shù)快速測定的可能,從市場上購得桂林市某乳品廠生產(chǎn)的消毒鮮奶增菌培養(yǎng)分離后,在本傳感器系統(tǒng)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7。用此標(biāo)準(zhǔn)曲線測定了同一產(chǎn)家的20袋鮮奶,同時用常規(guī)平板培養(yǎng)24h菌落計數(shù)法做平行對照測定,所得結(jié)果如表1。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析,相關(guān)系數(shù)R=0.979,說明兩種方法測得的結(jié)果有較好的一致性,使用本傳感器系統(tǒng)完全可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的平板培養(yǎng)24h菌落計數(shù)法對消毒鮮牛奶中的雜菌總數(shù)進(jìn)行快速、現(xiàn)場的測定。由于測定一份樣品的時間不超過10min,本傳感器系統(tǒng)除可用于乳品廠對新鮮牛奶的雜菌總數(shù)的快速測定外,若對儀器整機進(jìn)行便攜式設(shè)計,將可幫助工商管理人員和衛(wèi)生監(jiān)督監(jiān)測人員對新鮮牛奶的衛(wèi)生質(zhì)量實現(xiàn)所謂的“柜臺邊監(jiān)