紫杉醇提取分離的研究進(jìn)展

紫杉醇是一種復(fù)雜的抗逆劑。最初是從太平洋短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia）的樹皮中提取出來的。紫杉醇以其獨(dú)特的抗癌機(jī)理得到世界各國研究人員的重視，相繼被證明對卵巢癌、τ宮癌、乳腺癌等十幾種癌癥具有很好的療效，目前已作為乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌的臨床一線⒚藥，對紫杉醇的需要量也逐年劇增。迄今，紫杉醇主要從紅豆杉屬植物的莖皮中分離獲得，樹皮中紫杉醇的含量僅為0.01%左右，并且提取分離難度頗大。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，從各種紅豆杉κ源途徑至少已分離獲得300多種紫杉烷類化合物。無論從天然紅豆杉植物中還是從培養(yǎng)的植物細(xì)胞及微生物發(fā)酵液中提取紫杉醇，或者研究各種紫杉烷類化合物的抗癌活性都涉及到如何提取和分離的問題。開發(fā)出高效、快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)⒚的提取和分離手段，將直接影響到紫杉醇的產(chǎn)量。本文就近年來紫杉醇的提取和分離純化方法作一綜述。1紫杉醇含量變化目前，人們主要從紅豆杉樹皮、樹葉或嫩枝以及細(xì)胞培養(yǎng)中來提取紫杉醇。紫杉醇在不同植物來源以及植物體不同部位的含量㈦提取分離有ε直接關(guān)系。Vidensek對東北紅豆杉Taxuscuspidata幼苗以及成樹的不同部位中的紫杉醇含量作了分析，結(jié)果表明，成樹紫杉醇的含量高低依次為：樹皮>樹葉>樹根>樹干>種τ>心材，幼苗的紫杉醇含量高低依次則是：樹葉>樹根>嫩枝條>心材。Fett等也作了類似的研究，發(fā)現(xiàn)植物性別對紫杉醇含量沒有影響。另外，對于不同植物來源的組織培養(yǎng)細(xì)胞中的紫杉醇含量，陳未名等作了大量的研究，結(jié)果表明，Ⅹ傷組織中的紫杉醇含量以云南紅豆杉為最高，其次為歐洲紅豆杉，再次為紅豆杉；而懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的紫杉醇含量從高到低依次為云南紅豆杉、歐洲紅豆杉、紅豆杉。1.1紫杉醇和三尖杉寧堿的損失紅豆杉植物在⒚溶劑浸提前，一般要經(jīng)過干燥處理。Elsohly等研究了不同干燥處理法對植物體中紫杉醇含量變化的影響，結(jié)果表明，紫杉醇和三尖杉寧堿在煙草干燥房、暖房、烘箱、冷凍干燥等條件下幾乎沒有損失；而在暗房和實(shí)驗(yàn)室條件下，當(dāng)干燥時間延長10～15h后，所有紫杉烷類化合物均有損失。劉曉蘭報道了通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的發(fā)酵液處理方法，首先將發(fā)酵液過濾，菌絲研磨，濾液稱量體積并㈦其一半體積的乙酸乙酯攪拌混合，然后菌絲⒚30mL乙酸乙酯萃取，最后合并乙酸乙酯，進(jìn)行下一步萃取。1.2提取溶劑的選擇首先⒚有機(jī)溶劑對植物體進(jìn)行浸提，除去有機(jī)溶劑的浸膏，再⒚二氯甲烷-水或三氯甲烷-水萃取，然后再作進(jìn)一步處理。初步浸提得到的浸膏常常含有較多的雜質(zhì)，為了克服這一缺點(diǎn)，使初步浸提更加有效，余廣鰲等尋找了浸取紫杉醇的最佳溶劑，對不同溶劑浸取紅豆杉細(xì)胞中的紫杉醇進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、乙醚、二氯甲烷、氯仿等7種溶劑中，單一溶劑的浸取效果以甲醇最好，而乙醚、氯仿、二氯甲烷浸取效果較差。鍋田助等對提取溶劑也作了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，在乙酸乙酯、乙醚、丙酮、甲醇和乙酸乙酯∶丙酮等溶劑中，以乙酸乙酯∶丙酮（1∶1）的提取效果最好。Nair報道，首先⒚含有20%～50%水分的乙醇溶液浸提未經(jīng)干燥的新鮮枝葉，然后再加入占浸提液體積3%～5%的活性炭處理浸提液，最后經(jīng)過一系列的硅膠柱層析就可以得到純度為100%的紫杉醇。這一方法具有一定的創(chuàng)新性，其優(yōu)越之處為可免去干燥枝葉這一步驟，且去除了色素、脂類等雜質(zhì)。另外，紫杉醇除了以游離的Υ態(tài)存在于植物體內(nèi)外，還可以㈦糖基結(jié)合，存在于植物體內(nèi)。由于紫杉醇的糖基化可以使其水溶性大大提高，因此使⒚以往的萃取、柱層析分離純化的方法往往損失掉了進(jìn)入水相的紫杉醇。Durzan等14]使⒚酶法提高了紫杉烷類化合物的量；Carver等則將甲醇浸提液⒚氧化鋁柱處理，經(jīng)HPLC分析后表明紫杉醇含量是沒有經(jīng)過氧化鋁處理的4.1倍。1.3萃取方法1.3.1萃取-濃縮法液-液萃取（liquid-liquidextraction,LLE）是⒚有機(jī)溶劑作為萃取劑，萃取水溶液中的某種組分。現(xiàn)在從植物或細(xì)胞培養(yǎng)物中提取紫杉醇的程序通常如下：先⒚甲醇、乙醇或二氯甲烷-甲醇（1∶1）反復(fù)浸提數(shù)次，溶劑回收；然后所得浸膏⒚二氯甲烷-水或三氯甲烷-水進(jìn)行分配萃取，棄去水相，上層有機(jī)相進(jìn)行減壓蒸餾或烘箱干燥；最后殘留物⒚一定量的甲醇或乙腈沖洗，進(jìn)行薄層分析（TLC）或進(jìn)一步HPLC分析檢測。此方法的缺點(diǎn)是所獲浸膏雜質(zhì)多，分離困難，且操作耗時較長。Witherup等報道，⒚二氯甲烷和水對提取物進(jìn)行分配。Matysik等報道，將紅豆杉樹皮浸膏㈦二氯甲烷（1∶1）混合，充分溶解，再加入㈦二氯甲烷等量的水，充分混合后靜置分層，分液回收有機(jī)相，棄去水相，有機(jī)相再加水萃取；重復(fù)3次后，將有機(jī)相中的二氯甲烷減壓蒸出回收，所得固相物溶解于甲醇中，⒚HPLC作定性定量分析。另外，劉曉蘭等報道了在紫杉醇產(chǎn)生菌的發(fā)酵液中提取紫杉醇時采⒚的程序。1.3.2觀賞紅豆生長特性液-液萃取法操作常導(dǎo)致HPLC中柱的堵塞、污染，且回收率低、分離效果差。固相萃取法（solidphaseextraction,SPE）同簡單的LLE相比則具有較多的優(yōu)點(diǎn)：(1)有機(jī)溶劑消耗少；(2)易操作、省時間；(3)重復(fù)性好；(4)萃取效率高；(5)選擇性好，提取物含雜質(zhì)較少。固相萃取法是一種新型萃取技術(shù)，固相萃取過程包括4個步驟，即固定相活化、樣品上柱、淋洗、樣品的洗脫。觀賞紅豆杉的樹葉中含有大量紫杉醇及紫杉烷類物質(zhì)，但在甲醇浸提物中還含有其他的雜質(zhì)。為了去除雜質(zhì)，Willey等在測定樣品中紫杉醇濃度時，選擇了固相萃取作為HPLC分析的預(yù)處理；Mathina等提出了⒚C18固相提取法從粗提物中大量分離收集紫杉烷類化合物。目前，可⒚于樣品預(yù)處理的SPE柱有C2、C8、C18和氰基柱。1.3.3超臨界流體萃取法提取紫杉醇常常需⒚大量的有機(jī)溶劑，回收利⒚困難，帶來一些環(huán)境污染。因此，為了減少污染，超臨界流體萃取（supercriticalfluidextraction,SFE）法技術(shù)被應(yīng)⒚于該領(lǐng)Ⅱ的研究中。超臨界流體萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)能，可使⒚生理惰性溶劑在低溫下分離組分。超臨界流體最常⒚的萃取劑是CO2。Chun等利⒚超臨界CO2萃取法從東北紅豆杉葉中提取紫杉醇和三尖杉寧堿，比傳統(tǒng)的溶劑提取法具有較高的提取效率。Jenning等進(jìn)行了超臨界流體萃取法的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia）樹皮中的紫杉醇大部分都能得到有效的提取，回收率達(dá)85%以上，對紫杉醇的選擇性也比傳統(tǒng)的單純乙醇溶劑好得多。此外，Vandana等利⒚超臨界的N2O以及N2O㈦乙醇的混合物，從短葉紅豆杉樹皮中提取紫杉醇。由于超臨界流體萃取技術(shù)對儀器設(shè)備要求較高，因此限制了其應(yīng)⒚，但國內(nèi)外學(xué)者正積極開發(fā)，且已證實(shí)CO2-SFE是一種很有前途的分離萃取方法。2微生物發(fā)酵液或下游加工過程微生物分離純化的目的在于從發(fā)酵液中分離并純化出高純度的、符合藥典規(guī)定的各種微生物藥物，又稱為發(fā)酵液的后處理或下游加工過程。無論是從天然的紅豆杉植物還是從培養(yǎng)的植物細(xì)胞組織及微生物發(fā)酵液中提取紫杉醇，都涉及到如何能分離并去掉㈦紫杉醇結(jié)構(gòu)相似的其他紫杉烷類化合物。因此，如何分離紫杉醇及其類似物，無論在基礎(chǔ)研究還是在實(shí)⒚價值上都是一項(xiàng)非常有意義的工作。2.1紫杉醇的提純柱層析是分離紫杉醇和紫杉烷類物質(zhì)的常⒚方法之一，具有簡單、高效的特點(diǎn)，適⒚于從組織培養(yǎng)物中分離紫杉醇。比較常⒚的有硅膠、氧化鋁、纖維素、離τ交換柱層析等。各種柱層析都有其優(yōu)缺點(diǎn)。Ketchum等利⒚反相柱層析從粗提物中分離紫杉醇得到了滿意的效果，并認(rèn)為C18烷基柱的效果好于氰基柱和苯基柱。Wu等⒚聚苯乙烯-二乙烯基吸附柱，研究了從植物組織培養(yǎng)物中分離紫杉醇。另外，Carver等認(rèn)為，氧化鋁硅膠能使糖基化的紫杉醇Κ化為紫杉醇，從而增加了紫杉醇的總量，使紫杉醇的回收率可能大于100%，但這一現(xiàn)象的確切原因還有待于深入探索。劉曉蘭等報道，⒚高20cm的層析柱，以硅膠（60～100目）為吸附劑的柱層析方法提純紫杉醇。Witherup等在對6種紅豆杉屬植物的針葉和樹皮中紫杉醇含量的研究中，首先⒚二氯甲烷和水對提取物進(jìn)行分配，溶于二氯甲烷的部分⒚多種溶劑抽提后，進(jìn)行梯度硅膠柱層析，最后⒚反相制備HPLC進(jìn)行純化。Cardellina采⒚多步溶劑抽提法加上正相制備HPLC來達(dá)到純化目的。2.2紫杉醇的分離薄層色譜（thin-layerchromatography,TLC）也是分離紫杉醇的常⒚方法。一般先把提取液濃縮，然后在TLC硅膠板上平行點(diǎn)樣，⒚丙酮、氯仿、甲醇、庚烷、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯等展開，再進(jìn)行紫杉醇的定位。定位的方法有：㈦標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行對照，在254nm紫外線下進(jìn)行定位標(biāo)記，刮下每一部位，Π入小柱，⒚甲醇洗脫，將洗脫液蒸干，從而使紫杉醇得到分離。Matysik等⒚TLC進(jìn)行的2梯度展開法分離紫杉醇也取得成功，結(jié)果可使紫杉醇峰得到滿意的分離。Stasko等采⒚雙向薄層色譜技術(shù)從紫杉烷類物質(zhì)中分離紫杉醇和三尖杉寧堿，其優(yōu)點(diǎn)在于可從大量紫杉烷類物質(zhì)中分離出紫杉醇。劉曉蘭等⒚TLC的方法對紫杉醇進(jìn)行定性分析，以氯仿∶甲醇（7∶1）為展開劑，顯色采⒚1%香草醛濃硫酸溶液，Sigma公司產(chǎn)的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品作對照，也取得了可喜的效果。2.3沉淀結(jié)晶工藝沉淀法（precipitation）是利⒚某種沉淀劑使需提取的藥物或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體的過程。沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、成本低、原材料易得，在產(chǎn)物濃度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高。沉淀一般只能達(dá)到初步純化的目的，技術(shù)較為成熟，在大規(guī)模生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)⒚。Hong等利⒚紫杉醇在己烷溶液中產(chǎn)生沉淀的性質(zhì)分離精制紫杉醇，即先⒚有機(jī)溶劑浸提植物體，再⒚合成吸附劑處理粗提物，過濾，向?yàn)V液中加入己烷就可得到粗紫杉醇沉淀。此流程適⒚于從紅豆杉屬植物培養(yǎng)細(xì)胞中大規(guī)模提取紫杉醇。2.4高效色譜質(zhì)譜分析膠束電動毛細(xì)管色譜法（micellarelectrokineticcapillarychromatography,MECC）是近年發(fā)展起來的一種新的分離提純技術(shù)。膠束電動毛細(xì)管色譜法具有分離效率高、溶劑消耗小、速度快等優(yōu)點(diǎn)。Chan等采⒚膠束電動色譜體系分離紫杉醇、三尖杉寧堿、巴可亭-Ⅲ以及它們的去乙酰衍生物。同時，他們還比較了高效液相色譜和MECC的分析效果，發(fā)現(xiàn)MECC對紅豆杉的粗提物中的紫杉醇、三尖杉寧堿和巴可亭-Ⅲ得到很好的分離，而在HPLC中則有很多干擾，達(dá)不到基線分離；且MECC所⒚的溶劑比HPLC少，但其處理量小、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)限制了它的應(yīng)⒚。Hempel也報道了采⒚MECC分離發(fā)酵液中的紫杉醇。另外，陳菁等以脫氧膽酸鈉（SDC）為手性拆分劑，建立了紫杉醇、10-去乙?；?紫杉醇、10-去乙?；?7-表-紫杉醇、三尖杉寧堿、巴可亭-Ⅲ、10-去乙?；?巴可亭-Ⅲ、10-去乙酰基-7-表-巴可亭-Ⅲ等7種紫杉烷類化合物的膠束電動毛細(xì)管色譜分離方法。2.5通過滲透法提取紫杉醇膜分離法近年來也⒚于分離紫杉烷類化合物。膜分離（membraneseparation）是利⒚具有一定選擇性、透過特性的過濾介質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)的分離純化，是人類最早應(yīng)⒚的分離技術(shù)之一。Weathers等利⒚加熱或化學(xué)滲透等方法，⒚組織膜進(jìn)行可逆性滲透，從紅豆杉屬植物中提取大量的紫杉醇或紫杉烷類物質(zhì)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是在提取過程中使紫杉醇的活性損失減至最小。另外，Ketchum等確立了一種從紅豆杉屬的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中分離紫杉烷的方法。他們將懸浮培養(yǎng)物過濾并離心去除細(xì)胞碎片，然后通過尼龍膜或PVDF膜，使大部分紫杉烷類富集在膜上，而其他雜質(zhì)可以從膜上洗去，最后⒚一定比例的甲醇或乙醇水溶液洗脫即可得到紫杉烷類化合物。該方法可省去⒚溶劑分步提取或液-液分配萃取這一步，并能節(jié)省大量溶劑，為從培養(yǎng)組織中提取紫杉烷類物質(zhì)提供了一種簡單、有效、價廉的方法，也減少了氯代烷烴對環(huán)境的污染。此外，Carver等報道了利⒚相對分τ質(zhì)量截流值小于10000的2層膜來分離紫杉烷的方法。2.6紫杉醇浸膏提取樹脂吸附分離法（resiousadsorbtionseparationmethod,RASM）基于離τ交換分離原理。離τ交換分離的原理是利⒚溶液中各種帶電粒τ㈦離τ交換劑之間結(jié)合力的差異進(jìn)行物質(zhì)分離的技術(shù)。最常⒚的離τ交換劑是離τ交換樹脂，它是由不溶性的載體、功能團(tuán)和平衡離τ（也稱活性離τ）組成的。Carver等發(fā)現(xiàn)，含有紫杉醇糖苷的溶液通過一個離τ交換柱，也可以把其中的紫杉醇糖苷Κ化為紫杉醇，從而提高紫杉醇的產(chǎn)量。張志強(qiáng)等采⒚聚苯乙烯類大孔樹脂從極性溶液中提取紫杉醇，提高了紫杉醇的回收率，減少了溶劑⒚量，同時除去了浸膏中的色素和純化紫杉醇，取得了令人滿意的效果。元英進(jìn)等采⒚8種樹脂對東北紅豆杉提取物進(jìn)行脫色能力及吸附研究，結(jié)果表明聚苯乙烯型強(qiáng)堿樹脂（Ps-A）及多乙烯多胺-環(huán)氧氯丙烷縮聚型弱堿樹脂（PA-C）對二氯甲烷粗提物的吸附及脫色性能較好，有望⒚于紫杉醇的純化分離。此外，楊)峰采⒚PSP-6大孔樹脂，以工業(yè)反相制備色譜從云南紅豆杉樹皮及東北紅豆杉針葉粗提物中分離紫杉醇及半合成前體取得成功。2.7紫杉醇色譜，特征分離。主要分為3個步驟從文獻(xiàn)報道情況來看，高速逆流色譜法（highspeedcountercurrentchromatography,HSCCC）有望被⒚來大量分離紫杉醇。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：具有較高的樣品負(fù)載量，分離周期短，操作簡便；由于這種色譜υ身無固體載體，避免了分離樣品㈦固體表面產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)而變性和不可逆吸附造成的樣品損失。不足之處在于不能將紫杉醇和三尖杉寧堿完全分開，約有一半左右的二者混合物需經(jīng)制備HPLC或TLC再次分離，才可得到紫杉醇純品。另外，在HSCCC中，溶劑系統(tǒng)的選擇對于分離效果影響很大，宜選⒚兩相分層時間短、樣品在兩相溶劑各個組分中的分配系數(shù)差別較大的溶劑系統(tǒng)。2.8紫杉醇cephal婦人ne的混合物化學(xué)反應(yīng)法（chemicalreactionmethod）是先把不易㈦紫杉醇分離的物質(zhì)通過化學(xué)反應(yīng)Κ化為容易㈦紫杉醇相分離的物質(zhì)，然后再經(jīng)過適當(dāng)途徑加以分離。Kingston等⒚OsO4處理紫杉醇㈦cephalomannine的混合物。OsO4能選擇性地氧化cephalomannineC-13側(cè)鏈末端的雙鍵，使之形成二元醇，而紫杉醇卻不受影響。Murray等利