廣藿香抑菌活性成分的提取及抑菌活性研究

目前，化學(xué)提取物的安全性仍有爭(zhēng)議。通過(guò)廣泛、安全、高效的天然食品提取物，已成為食品、工業(yè)和生物領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)植物資源的研究非?；钴S,從植物中提取的某些活性物質(zhì)具有抗菌、抗氧化和其他生理作用,為植物源防腐劑的發(fā)展提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。我國(guó)學(xué)者研究了大蒜、生姜、丁香等50多種香辛科植物及大黃、甘草、銀杏葉等200多種中草藥及其他植物如竹葉等提取物的抗菌實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)有150多種具有廣譜的抑菌活性,并作為天然防腐劑在某些食品中作了一些簡(jiǎn)單的應(yīng)用。廣藿香為唇形科植物廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth.)的地上部分,為多年生草本或灌木。原產(chǎn)亞洲菲律賓等亞熱帶地區(qū),我國(guó)藥材主產(chǎn)于廣東、海南。葉既可食用,也可藥用。含揮發(fā)油,油中主成分為廣藿香醇(patchoulialcohol),另有α-、β-和γ-廣藿香萜烯(α-,β-,γ-patchoulene)、廣藿香萜醇(patchoulenol)、廣藿香酮(pogostone)、丁香烯等?！侗静菥V目》記載其主治“風(fēng)水毒腫,去惡氣,止霍亂心腹痛。脾胃吐逆為要藥。助胃氣,開胃口,進(jìn)飲食。溫中快氣,肺虛有寒,上焦壅熱,飲酒口臭,煎湯漱之”。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇、乙醚和水作為溶劑,分別提取廣藿香中的有效成分,研究其抑菌性能及對(duì)常見食品的防腐保鮮作用,旨在為廣藿香作為天然食品防腐劑的合理開發(fā)和綜合利用提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1原材料廣藿香:2008年7月采于廣州黃埔區(qū),除根曬干;供試果蔬:色澤均勻、新鮮、表面無(wú)破損的葡萄、草莓和青椒。1.1.2菌株微生物指標(biāo)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、常見青霉(Penicilliumfrequentans)、黑根霉(Rhizopusnigricans)、熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)和啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae):廣東省微生物研究所。1.1.3培養(yǎng)基1.1.4主要設(shè)備1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1乙醇提取物的制備廣藿香莖葉干燥、粉碎,每100g加入150mL乙醇,振蕩,45℃水浴浸取24h,取上清液;渣中加入50mL乙醇,相同條件下浸提24h,取上清液,合并清液。清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮成1g/mL,得到乙醇提取物。同法制備乙醚提取物、水提取物。1.2.2菌種和酵母培養(yǎng)方法將菌種接種到相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基,細(xì)菌37℃培養(yǎng)24h,霉菌28℃培養(yǎng)72h,酵母28℃培養(yǎng)48h,連續(xù)培養(yǎng)3次。以無(wú)菌生理鹽水配制成菌體或孢子濃度為106~107cfu/mL的菌懸液,備用。1.2.3菌液的制備選用直徑為12cm的培養(yǎng)皿,每皿加30mL培養(yǎng)基,凝固后,移取各菌懸液0.5mL分別加入各平板上,涂布均勻,每皿平穩(wěn)、等距離放置5個(gè)滅菌牛津杯,于其中滴加提取物,以無(wú)菌生理鹽水和5%苯甲酸鈉作為對(duì)照。每菌3個(gè)重復(fù)。移去牛津杯,量取各抑菌圈直徑。1.2.4菌種的制備采用二倍稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度。取10支無(wú)菌小試管,各加滅菌培養(yǎng)液1mL,第1管加原提取液1mL,混勻后吸取1mL于第2管,混勻后吸取1mL于第3管,依次類推到第9管,棄去1mL,第10管改加1mL無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照,每管加菌懸液0.1mL,搖勻。置于200r/min的振蕩器上培養(yǎng)。結(jié)果判定:培養(yǎng)液清亮透明表示無(wú)菌生長(zhǎng),渾濁表示有菌生長(zhǎng),以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最低抑菌濃度。1.2.5最低細(xì)菌濃度mc的測(cè)量在1.2.4實(shí)驗(yàn)中,從無(wú)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中取出0.1mL涂布平板,培養(yǎng),觀察是否有菌生長(zhǎng)。以無(wú)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最低殺菌濃度。1.2.6培養(yǎng)基的制備用自來(lái)水配制細(xì)菌培養(yǎng)液,配成pH3~11系列培養(yǎng)基,分別取pH3、4、5、6、7、8、9、10、11,分裝試管,作為對(duì)照;用乙醇、乙醚、水提取物分別代替自來(lái)水,同法配制pH3~11系列培養(yǎng)液。培養(yǎng)基均不滅菌,37℃培養(yǎng)48h。用分光光度計(jì)分別測(cè)定相應(yīng)pH下的吸光度OD系列值。1.2.7抑菌性測(cè)定將提取物分別置于60、80、100℃水浴和121℃濕熱條件下處理20min,測(cè)定對(duì)所試菌株的抑菌性。每菌重復(fù)3次,按1.2.3量取抑菌圈直徑。1.2.8測(cè)定指標(biāo)的測(cè)定保鮮實(shí)驗(yàn):將果蔬樣品放入提取物中浸泡1min,取出后強(qiáng)制通風(fēng)晾干;裝入無(wú)菌、干燥容器中,30℃陰涼處存放7d。以不浸泡提取物的樣品作為對(duì)照。肉眼觀察樣品的變化情況,測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。失質(zhì)量率的測(cè)定:失質(zhì)量率(%)=(貯藏前質(zhì)量-貯藏一定時(shí)間后質(zhì)量)/貯藏前質(zhì)量×100Vc含量的測(cè)定:采用2,6-二氯靛酚滴定法?？扇苄怨绦挝锏臏y(cè)定:采用手提折光計(jì)。微生物數(shù)量的測(cè)定:按照參考文獻(xiàn)測(cè)定細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌菌落總數(shù)。抑菌率的測(cè)定:抑菌率(%)=(B-A)/B×100式中:B為對(duì)照樣品菌落數(shù);A為提取物處理樣品的菌落數(shù)。2結(jié)果與分析2.1根霉的抑制作用廣藿香不同溶劑提取物對(duì)食品中9種常見污染菌的抑制作用如表1。由表1可知,提取物對(duì)黑根霉有很強(qiáng)的抑制作用,對(duì)兩種腸道桿菌、黑曲霉和啤酒酵母的抑制效果不明顯,抑菌順序?yàn)?黑根霉>金黃色葡萄球菌>熱帶假絲酵母>常見青霉>枯草芽孢桿菌>鼠傷寒沙門氏菌>黑曲霉>大腸桿菌>啤酒酵母。各提取物的抑菌效果順序?yàn)?乙醚提取物>乙醇提取物>水提取物。2.2相同菌株對(duì)黑根霉mic的mic結(jié)果鑒于提取物對(duì)兩種腸桿菌、黑曲霉和啤酒酵母的抑制作用很弱,本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定了其他5種菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。測(cè)定結(jié)果見表2。由表2可得,對(duì)相同菌株而言,乙醚提取物的MIC最小,乙醇提取物次之,水提取物的MIC最大,3者對(duì)黑根霉的MIC分別為0.015、0.031g/mL和0.062g/mL;對(duì)同一提取物來(lái)說(shuō),黑根霉的MIC最小,枯草桿菌的MIC最大,其他菌株的MIC居中,乙醚提取物對(duì)黑根霉、枯草桿菌的MIC分別為0.015g/mL和0.125g/mL。2.3水提取物對(duì)黑根霉、枯草桿菌、青霉的影響對(duì)所試菌株的最低殺菌濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。從表3可以看出,乙醇、乙醚、水提取物對(duì)黑根霉的MBC分別是0.125、0.062g/mL和0.25g/mL,水提取物對(duì)枯草桿菌、青霉的MBC達(dá)到1g/mL。再次表明提取物對(duì)黑根霉具有良好的抑菌活性,3者中水提取物的抑制作用較弱。2.4抑菌ph的確定測(cè)定不同pH系列培養(yǎng)物的OD值,結(jié)果見圖1。由圖1可知,在pH4~10范圍內(nèi),由各提取物配制成的培養(yǎng)液OD值明顯小于同pH值的對(duì)照,說(shuō)明了其中雜菌生長(zhǎng)濃度較低,表明提取物的抑菌pH范圍為pH4~10,具有廣譜抑菌性。此外,在pH7附近的OD值最大,而在pH值較低和較高時(shí)的OD值較小,是因?yàn)榈蚿H和高pH本身對(duì)細(xì)菌具有一定的抑制作用。2.5不同溫度對(duì)水提物抑菌圈直徑的影響本實(shí)驗(yàn)挑選了抑菌效果較好的金黃色葡萄球菌、黑根霉和熱帶假絲酵母為指示菌,測(cè)定了經(jīng)不同溫度處理的各提取物的抑菌圈直徑,結(jié)果如表4。由表4可知,水提取物在溫度低于100℃處理后的抑菌性能大大降低,但仍表現(xiàn)出一定的抑制作用,高溫處理后基本沒有抑菌效果;其他兩種提取物在60~100℃的溫度處理后,其抑菌活性變化不大,但121℃處理對(duì)抑菌效果有明顯的影響。說(shuō)明乙醇、乙醚提取物的使用溫度應(yīng)低于100℃。2.6乙醇、乙烯提取物對(duì)果蔬中3種菌種的保鮮作用葡萄、草莓和青椒經(jīng)各提取物處理,在30℃存放一周后,進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn),結(jié)果見表5~表7。由表5可得,經(jīng)過(guò)30℃貯藏7d后,未經(jīng)處理的對(duì)照樣品已經(jīng)開始腐爛,而經(jīng)乙醇和乙醚提取物處理的樣品顏色沒有變化,僅質(zhì)地稍變軟,但水提取物處理的食品顏色發(fā)生變化,質(zhì)地也明顯變軟。表明,乙醇、乙醚提取物具有較好的防腐保鮮作用。由表6可以看出,用乙醚提取物處理,草莓的失水率最低,為0.04%;葡萄的Vc下降率最低,含量保持5.2mg/100g;草莓的可溶性固形物下降率最低,含量為6.5%;乙醚提取物的保鮮作用最好,水提取物的效果最弱。表明提取物處理能減少果蔬的水分、Vc和可溶性固形物的損耗,延長(zhǎng)果蔬的保質(zhì)期。由表7可知,各提取物對(duì)果蔬中細(xì)菌、霉菌和酵母菌都有較好的抑制作用。對(duì)細(xì)菌的抑制率最高為94.5%,最低為78.4%;對(duì)霉菌的抑制率最高為90.8%,最低為73.8%;對(duì)酵母菌的抑制率最高為93.7%,最低為78.4%。乙醚提取物對(duì)3種菌的抑制率都最高。綜合表5~表7可以看出,經(jīng)過(guò)提取物處理的食品,貯藏效果明顯優(yōu)于未經(jīng)處理的,可以開發(fā)為天然食品防腐劑。3種提取物的保鮮作用廣藿香提取物具有較好的抑菌防腐性能,3種提取物的抑菌效果為:乙醚提取物>乙醇提取物>水提取物;3者對(duì)黑根霉的效果最好,對(duì)兩種腸桿菌、黑曲霉和啤酒酵母基本沒有抑制作用;對(duì)黑根霉的最低抑菌濃度分別為0.015、0.031、0.062g/mL,最低殺菌濃度分別是0.062、0.125、0.25g/mL;各提取物都具有廣譜抑菌性,抑菌pH范圍為pH4~10;水提取物的熱穩(wěn)定性較差,100℃處理后喪失抑菌效果,乙醇、乙醚提取物在溫度低于121℃時(shí),熱穩(wěn)定性好。提取物處理食品,能保持食品的色澤、質(zhì)地,延緩食品中水分、Vc和可溶性固形物的下降,抑制其中微生物的生長(zhǎng)。3種提取物中,乙醚提取物的保鮮作用最好,水提取物的效果最弱;用乙醚提取物處理的食品,草莓的失水率、葡萄的Vc下降率、草莓的可溶性固形物下降率最低,分別是0.04%、10.3%和21.7%;乙醚提取物對(duì)食品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌的抑制率最高,分別為94.5%、90.8%和93.7%。我國(guó)衛(wèi)生部公布廣藿香可以藥食兼用,既可作為中草藥,也可用作食用香料,因此其安全性很高,可以作為植物源天然食品防腐劑進(jìn)一步研究。另一種原產(chǎn)于我國(guó)的藿香(Agastacherugosa(Fisch.etMey.)Kuntze),又稱土藿香或野藿香,與廣藿香同科不同屬,二者地域和來(lái)源以及形態(tài)差異很大,化學(xué)成分也多不相同。現(xiàn)有的研究主要集中在藿