肝纖維化與gf信號(hào)通路

肝纖維是指由多種慢性疾病引起的持續(xù)肝臟損傷和修復(fù)反應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)（cem）。過度沉積和肝臟功能受損。對(duì)肝纖維化的細(xì)胞及分子機(jī)制研究表明,多種細(xì)胞參與了肝纖維化的形成,其中激活的肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell,HSC)是促進(jìn)ECM過度沉積的主要細(xì)胞,而多種細(xì)胞因子參與了肝星狀細(xì)胞的激活,其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfactor,TGFβ)被認(rèn)為是最關(guān)鍵的因素。其可激活肝星狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)ECM的合成和降解平衡。以干擾TGFβ及其細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的抗肝纖維化治療已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。這樣一種具有多種生物活性的細(xì)胞因子對(duì)正常健康的維持同樣非常重要,所以在TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)纖維化的形成具有特異性作用的下游通路將成為抗纖維化治療的重要靶點(diǎn)。本文綜述了TGFβ與肝纖維化形成的關(guān)系,相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及以此為靶點(diǎn)的抗纖維化治療。1tgf受體的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)TGFβ來(lái)源廣泛,HSC、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等都可以分泌。目前認(rèn)為TGFβ至少有6種亞型,哺乳動(dòng)物主要是TGFβ1～33種亞型,其中TGFβ1是細(xì)胞和組織中最豐富的TGFβ成員,由于其啟動(dòng)子的調(diào)控較為復(fù)雜,其失控導(dǎo)致的疾病最為多見。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展與TGFβ1的關(guān)系也最為密切。根據(jù)TGFβ受體結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn),可將其分為3類,即TGFβⅠ型受體(TβRⅠ)、TGFβⅡ型受體(TβRⅡ)和TGFβⅢ型受體(TβRⅢ)。其中TβRⅠ和TβRⅡ跨膜區(qū)含絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的Ser/Thr蛋白激酶活性。TβRⅠ的胞質(zhì)近膜區(qū)有一個(gè)特異的、高度保守的富含絲氨酸(Ser)/甘氨酸(Gly)的結(jié)構(gòu)域,稱為GS結(jié)構(gòu)域,是受體激酶活性的作用區(qū)域。TGFβⅢ也稱為輔助受體。TGF-β先與TβRⅡ結(jié)合形成受體復(fù)合物,同時(shí)激活TβRⅡ磷酸化激酶,TβRⅠ識(shí)別此復(fù)合物并與之結(jié)合,又被TβRⅡ磷酸化激酶磷酸化而激活,進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的產(chǎn)生。2tgf/smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要通過受體絲氨酸/酪氨酸激酶途徑及胞內(nèi)的Smad蛋白途徑,在過去的10多年中,Smad轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為介導(dǎo)TGFβ信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的最主要途徑,對(duì)TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制的研究也較為深入。肝纖維化中,HSC的激活分化及對(duì)膠原蛋白的合成等方面都受到TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。而越來(lái)越多的證據(jù)表明,非Smad途徑也參與了TGFβ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。2.1聚體衍生物co-smad根據(jù)Smad蛋白在TGFβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,可將其分為3類:膜受體激活的Smads(receptor-activatedSmads,R-Smads),包括Smad1,2,3,5和8;通用Smad(commonmediatorSmads,Co-Smad),目前發(fā)現(xiàn)的只有Smad4;抑制性Smad(inhibitorySmads,I-Smads),包括Smad6、7,為TGFβ/Smad信號(hào)通路的抑制分子。TGFβ與其受體結(jié)合后可激活Smad2和Smad3并磷酸化,其與Smad4形成異源三聚體復(fù)合物易位入核,與DNA結(jié)合,通過和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)。在整個(gè)Smad通路中,經(jīng)過多步的磷酸化反應(yīng),核質(zhì)穿梭運(yùn)動(dòng)及蛋白酶體的降解,最終由I-Smads終止反應(yīng)。I-Smads由Smads信號(hào)誘導(dǎo),在細(xì)胞核中聚積并在TGFβ刺激下被轉(zhuǎn)運(yùn)出核與TβRⅠ結(jié)合,通過阻止R-Smad磷酸化反應(yīng)及R-Smad-Smad4復(fù)合物的形成及受體脫磷酸化而進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),TGFβ/Smad通路中各型Smads分子之間精密協(xié)調(diào),共同完成生理及病理狀態(tài)下TGFβ的生物學(xué)效應(yīng)。2.2tgf調(diào)節(jié)的相關(guān)基因Smad通路并非TGFβ調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的唯一通路,其他的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括絲裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPKs)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/Akt通路等,這些通路可直接由TGFβ介導(dǎo)或者參與調(diào)節(jié)TGFβ-Smad通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。實(shí)際上Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間有廣泛的串話(crosstalk),以此對(duì)Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié),并賦予了TGFβ多重的生物學(xué)活性。在一些細(xì)胞中Smad對(duì)一些TGFβ反應(yīng)來(lái)說(shuō)并非必要,甚至可能是通過MAPK依賴機(jī)制或其他途徑。2.2.1tgf與mapk通路及其聯(lián)合關(guān)系MAPK通路是目前有關(guān)與TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中除Smad通路之外研究最多的通路。MAPK通路是激活后向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并作用于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)蛋白激酶家族。目前在真核細(xì)胞中已確定有4條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularregulatedKinase,ERK)、c-JunN-terminalkinase(JNK)、p38和ERK5通路。MAPKs可激活多種蛋白激酶、核蛋白及轉(zhuǎn)錄因子,而介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在對(duì)TGFβ-Smad通路的深入了解的基礎(chǔ)上,對(duì)TGFβ與MAPK通路的關(guān)系及其在多種器官的纖維化疾病中的作用也引起了廣泛的重視。特發(fā)性肺纖維化過程中,TGFβ通過磷酸化p38MAPK及JNK而介導(dǎo)肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK在瘢痕組織成纖維細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)TGFβ的轉(zhuǎn)錄。在糖尿病腎病中,TGFβ可增加p38、ERK1/2及JNK的磷酸化,誘導(dǎo)纖維結(jié)合蛋白(fibronectin,FN)合成增加。在肝纖維化中MAPK通路通過多種途徑參與了肝星狀細(xì)胞的激活、增殖、凋亡等過程。TGF-β通過上游的TGF-β激活激酶-1(TGF-β-activatedkinase-1,TAK1)和MKK3/6誘導(dǎo)p38MAPK信號(hào)的激活。HSC激活的過程中,TGFβ1mRNA的表達(dá)明顯增加,阻斷ERK活性后能有效抑制HSC自分泌TGFβ1的過程,也表明ERK信號(hào)通路參與了調(diào)控HSC自分泌TGFβ1的過程;分別阻斷p38MAPK及Smad通路,HSCα(Ⅰ)型膠原基因表達(dá)降低,同時(shí)阻斷兩條通路抑制作用更為明顯。Smad通路及MAPK通路分別獨(dú)立并可協(xié)同的增加HSCα(Ⅰ)型膠原的基因表達(dá),但TGFβ刺激α(Ⅰ)型膠原mRNA的穩(wěn)定性增加是通過p38MAPK通路而非Smad通路。在HSC轉(zhuǎn)分化的過程中,TGFβ激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并進(jìn)一步導(dǎo)致Smad3與Smad2的連接部位磷酸化,促進(jìn)Smad3和Smad4復(fù)合體的形成及轉(zhuǎn)位入核而發(fā)揮作用。2.2.2pka抑制劑的作用機(jī)制3′,5′-環(huán)磷酸腺苷酸(cyclicadenosine3′,5′-monophosphate,cAMP)是一種廣泛存在的、介導(dǎo)多種激素細(xì)胞反應(yīng)的重要第二信使,研究表明,cAMP途徑參與了組織纖維化的形成。G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor,GPCR)激動(dòng)劑通過Gs途徑激活A(yù)C而刺激cAMP的升高,進(jìn)而抑制膠原的合成。有學(xué)者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),AC的激活及過度表達(dá)可抑制心肌成纖維細(xì)胞的形成及膠原的合成。磷酸二酯酶抑制劑、腺苷酸環(huán)化酶激活劑及外源性的前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)等可通過增加cAMP濃度而干擾TGFβ誘導(dǎo)的Smad特異性的基因轉(zhuǎn)錄。使用PKA(proteinkinaseA)特異性抑制劑H-89來(lái)阻斷cAMP的主要下游通路PKA,可以抑制cAMP依賴性的Smad通路中的基因表達(dá)。共表達(dá)PKA催化亞單位及cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPresponseelement-bindingprotein,CREB)也可以抑制Smad通路中的基因轉(zhuǎn)錄。提示,cAMP通過PKA依賴性的、CREB介導(dǎo)的途徑抑制TGFβ/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及后續(xù)的基因轉(zhuǎn)活。2.2.3pi3-k抑制劑的激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)是一個(gè)異源二聚體蛋白。PI3-K的激活對(duì)HSC的增殖和趨化性有重要作用。用PI3-K抑制劑LY294002和通過轉(zhuǎn)染顯性失活突變的Akt來(lái)抑制Akt,可明顯減少HSC增殖及α1(Ⅰ)膠原mRNA和蛋白水平。用組成性表達(dá)Akt活性形式的腺病毒轉(zhuǎn)化HSC,在低血清條件下可誘導(dǎo)HSC增殖。研究表明,PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以被TGFβ調(diào)節(jié)。Bakin等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PI3-K的抑制劑LY294002,可以阻止TGFβ1誘導(dǎo)的Smad2磷酸化反應(yīng),表明Smad蛋白也可能是PI3-K通路的一個(gè)靶點(diǎn)。TGFβ1可以激活PI3-K下游通路中的PDK-1及Akt,LY294002或Aktdn結(jié)構(gòu)可以終止TGFβ1刺激的α2(Ⅰ)膠原基因的轉(zhuǎn)錄。另外,阻斷PI3-K可以降低Smad3的活性。表明,在Smads和PI3K在調(diào)節(jié)TGFβ1介導(dǎo)的Ⅰ型膠原的表達(dá)中存在crosstalk。NF-κB為同源或異源二聚體的轉(zhuǎn)錄因子,HSC的激活與NF-κB異常持續(xù)性激活有關(guān)。NF-κB持續(xù)激活且IκB表達(dá)減少導(dǎo)致許多NF-κB的應(yīng)答基因如IL-6、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule1,ICAM-1)在激活HSC中組成性的表達(dá)。NF-κB在保護(hù)激活HSC免受腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中也起重要作用。體內(nèi)研究表明HSC激活時(shí)可伴有NF-κB的激活及c-myb基因表達(dá)的增強(qiáng),而c-myb蛋白可結(jié)合于α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)基因的調(diào)控區(qū),表明NF-κB及c-myb在HSC激活過程中具有重要作用。3化纖靶點(diǎn)TGFβ在肝纖維化中的重要作用決定了TGFβ及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為了抗纖維化的主要靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外通過各種途徑尋找干擾信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的策略,目前的研究包括對(duì)TGFβ本身的影響,干擾受體與配體的結(jié)合及其活性,以及針對(duì)后續(xù)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的治療等等,其中也包括中藥和天然藥物對(duì)肝纖維化治療作用的研究。3.1細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞因子與tgf有研究表明,腎素-血管緊張素系統(tǒng)通過促進(jìn)TGFβ的分泌合成而在肝纖維化的形成中具有重要作用,應(yīng)用血管緊張素受體阻斷劑及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化,結(jié)果表明,TGFβmRNA水平劑TGFβ蛋白表達(dá)明顯降低。在體外細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),重組的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)TGFβ及TGFβmRNA的表達(dá)具有阻斷作用。另一方面阻斷TGFβ的激活也具有重要意義。Thrombospondin-1(TSP-1),一種參與細(xì)胞損傷反應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì),被認(rèn)為是TGFβ前肽復(fù)合物的重要激活因子。在二甲亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中干擾潛在相關(guān)肽(latency-associatedpeptide,LAP)與TSP-1的相互作用,可以阻止肝臟的損壞及纖維化的形成這種因子在先天性肝纖維化中的表達(dá)增高。在DMN誘導(dǎo)的肝纖維化模型中,這種肽段可以通過抑制TGFβ的激活及后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)阻止肝損傷及纖維化的進(jìn)程。在細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中,中和激活的HSC中的TSP-1可以阻斷TGFβ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。3.2對(duì)肝纖維化的作用大鼠注射表達(dá)dnTβRⅡ的病毒載體后連續(xù)使用DMN誘導(dǎo)肝纖維化,結(jié)果過度表達(dá)的dnTβRⅡ可降低DMN誘導(dǎo)肝纖維化的生成。Ueno等在實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了可表達(dá)融合了人IgG的TβRⅡ外功能區(qū)的腺病毒載體,這種嵌合分子可以通過影響TGFβ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而減輕DMN誘導(dǎo)的肝纖維化。在肝纖維化大鼠中應(yīng)用可溶性TβRⅡ(solubleTβRⅡ),發(fā)現(xiàn)可溶性TβRⅡ可降低膠原沉積,并可減少HSC的激活及增殖。其作用的發(fā)揮即通過可溶性TβRⅡ與胞膜TβRⅡ競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGFβ抑制其信息傳遞。TGFβ中和抗體的應(yīng)用是抗纖維化治療的一個(gè)重要進(jìn)展,TGFβ通過中和抗體中和循環(huán)中的TGFβ而阻止其效應(yīng)。一種可以抑制各種TGFβ亞型的鼠單克隆抗體(1D11)對(duì)鼠腎臟纖維化的形成也具有抑制作用。把1D11用于膽管結(jié)扎(bileductligated,BDL)誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠時(shí),對(duì)組織學(xué)及纖維化分子標(biāo)記物的分析也顯示中和抗體由于抗肝纖維化治療的有效性。3.3抗纖維化作用機(jī)制由于并非所有的TGFβ作用都應(yīng)該被阻斷,所以針對(duì)TGFβ的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷更具有特異性。Dooley等通過門靜脈注射攜帶有Smad7cDNA的腺病毒載體,Smad7高表達(dá)的BDL大鼠膠原表達(dá)及羥脯氨酸的含量均降低。α-SMA的染色明顯降低,表明HSC的激活受到抑制。更為重要的是,Smad7對(duì)體外培養(yǎng)的HSC的增殖及激活具有抑制作用,對(duì)已經(jīng)形成的肝纖維化也具有影響。其主要機(jī)制是通過抑制Smad2/3磷酸化及活化的Smad復(fù)合物核轉(zhuǎn)位來(lái)影響TGFβ的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外一個(gè)可以特異性的阻斷TGFβ下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的方法是阻斷Smad3,在多種器官中均證實(shí)Smad3對(duì)纖維化反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。一種從大豆中提取的物質(zhì)在培養(yǎng)的HSC中可以降低由TGFβ誘導(dǎo)的膠原聚積。使用p38MAPK抑制劑SB-203580及過氧化氫酶可以上調(diào)膠原mRNA水平,表明H2O2和p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與了此膠原合成的調(diào)節(jié),該提取物對(duì)HSC膠原的合成也表現(xiàn)出顯著的作用。作用于p38