病毒受體的研究進(jìn)展

病毒受體的研究一直是病毒研究的熱點(diǎn)。病毒受體是病毒入侵靶細(xì)胞的門戶,能特異性的與病毒結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵,是關(guān)系到病毒宿主范圍的一個(gè)決定性因素。隨著研究手段的進(jìn)步,近年來(lái)有關(guān)病毒受體的研究已有較大進(jìn)展,部分病毒受體的結(jié)構(gòu)和功能已在不同程度上得到確認(rèn)。絕大多數(shù)受體的本質(zhì)是蛋白,所以研究蛋白相互作用的方法都可用來(lái)研究受體。鑒定受體的研究方法總體上從蛋白和基因兩個(gè)途徑入手。較早用于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法是偶聯(lián)、免疫共沉淀等生物化學(xué)方法及病毒蛋白鋪覆技術(shù)(Virusoverlayproteinblotassay,VOPBA)等。近年來(lái)開始采用一些以DNA重組克隆為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法,如噬菌體展示、酵母雙雜交系統(tǒng)等。每一種方法各有所長(zhǎng),有時(shí)需要聯(lián)合應(yīng)用,相互印證結(jié)果的可靠性。WSSV(對(duì)蝦白斑綜合癥病毒)是近年來(lái)對(duì)蝦暴發(fā)性流行病的主要病原,如果我們掌握了其受體的結(jié)構(gòu)、功能,就可以更好的了解病毒的傳染機(jī)制、致病機(jī)理。預(yù)防與治療的思路之一,就是從切斷傳播途徑入手,合成類似受體的、可與病毒結(jié)合的阻斷劑、抗體等新型藥物,來(lái)控制病害的蔓延與傳播;另外就是根據(jù)其受體基因結(jié)合遺傳育種技術(shù)篩選、培育抗病個(gè)體。目前相關(guān)WSSV受體的研究報(bào)道還較少,本文旨在通過(guò)對(duì)可用于病毒受體鑒定的方法進(jìn)行介紹和總結(jié),為對(duì)蝦病毒受體的篩選鑒定提供參考。1病毒與受體的結(jié)合病毒鋪覆蛋白印跡技術(shù)是較早用與病毒受體鑒定的方法。它是在Western印跡技術(shù)的基礎(chǔ)上,利用病毒與受體特異性結(jié)合的特點(diǎn),對(duì)病毒受體進(jìn)行鑒定的方法。它的基本操作步驟是,利用清潔劑裂解細(xì)胞膜然后做SDS電泳,轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜,與病毒結(jié)合,最后洗去未結(jié)合病毒。病毒與受體結(jié)合的顯示方法有兩種:一是直接利用同位素標(biāo)記的病毒粒子;二是用單克隆抗體或多抗與病毒結(jié)合。使用多抗要避免與寄主蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),如有交叉反應(yīng),可通過(guò)寄主蛋白預(yù)吸收封閉與多抗結(jié)合的寄主蛋白來(lái)消除。使用本方法的前提是受體活性是由單一多肽決定而不需要膜的其它組份,而且經(jīng)過(guò)裂解液的處理不會(huì)喪失活性。如是碳水化合物型受體,就可用薄層層析來(lái)分離糖脂,然后檢測(cè)與病毒的結(jié)合情況。用此方法進(jìn)行受體研究的病毒有:登革熱病毒、斜紋夜蛾多角體包埋型病毒、牛病毒性腹瀉病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、偽狂犬病毒、豬流行性腹瀉等。2噬菌體的分子檢測(cè)噬菌體展示的基本原理就是將外源基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中使之與衣殼蛋白融合表達(dá),隨著噬菌體的成熟裝配,融合蛋白展示于噬菌體表面并能保持較好的空間構(gòu)型。到目前為止,利用此方法已陸續(xù)建立了噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)、cDNA展示文庫(kù)等技術(shù),并廣泛用于配體-受體關(guān)系的研究中。以絲狀噬菌體為例,絲狀噬菌體屬于單鏈DNA病毒,其DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制,細(xì)菌不被裂解,但生長(zhǎng)速度減慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌體顆粒(每代約100個(gè))。較早發(fā)展的是f1,fd和M系列絲狀噬菌體載體,它們的單鏈DNA長(zhǎng)約7000bp,一級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似(99%同源性)。其編碼的主要衣殼蛋白為pⅧ,其次為pⅢ,pⅥ,pⅦ和pⅣ。展示區(qū)利用的是pⅢ和pⅧ的N端,因?yàn)榇硕耸怯坞x的。要表達(dá)的序列插入其末端以融合蛋白的形式表達(dá)。利用噬菌體篩選目的蛋白基于3個(gè)基本事實(shí)①插入外源基因并表達(dá)在噬菌體顆粒表面,不影響噬菌體的生活周期,同時(shí)其外源蛋白天然構(gòu)象也能被相應(yīng)的抗體或受體所識(shí)別②利用連接于固相支持物(玻璃珠、酶標(biāo)板等)的靶分子(或統(tǒng)稱篩選劑或受體),可以采用適當(dāng)?shù)腜anning方法(親和、洗脫、擴(kuò)增、親和的循環(huán)步驟)洗去非特異結(jié)合的噬菌體,最終篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體(或統(tǒng)稱配體)③外源蛋白或多肽表達(dá)在噬菌體表面,其編碼基因與噬菌體DNA是偶聯(lián)的,通過(guò)分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來(lái),這是其它一些技術(shù)做不到的,此技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可在體外完成對(duì)外源多肽或蛋白的研究并方便的獲得目的DNA序列。這類單鏈?zhǔn)删w是測(cè)序和突變分析的理想材料,不足是培養(yǎng)期長(zhǎng)、不穩(wěn)定、表達(dá)的肽鏈較短。近年來(lái)發(fā)展的λ噬菌體、T7噬菌體等裂解性噬菌體載體生長(zhǎng)快,穩(wěn)定性強(qiáng),可表達(dá)較長(zhǎng)序列,并且其構(gòu)象更接近于天然情況,適合用來(lái)構(gòu)建cDNA展示文庫(kù),董倩等利用T7cDNA噬菌體展示方法篩選了乙型肝炎病毒前S1蛋白的結(jié)合蛋白。由于原核表達(dá)系統(tǒng)沒有對(duì)真核基因內(nèi)含子的剪接功能,所以噬菌體展示系統(tǒng)只能表達(dá)原核生物基因、不需要內(nèi)含子及外顯子拼接的DNA病毒,或是由真核生物或RNA病毒等的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA。3酵母雙雜交系統(tǒng)論yeastwell隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,近年來(lái)開發(fā)了一些研究蛋白之間相互作用的更簡(jiǎn)便有效的方法。其中之一是由Fields和Song創(chuàng)立的酵母雙雜交系統(tǒng)(YeastTwo-HybridSystems),與傳統(tǒng)方法相比,它最突出的特點(diǎn)是可以在酵母這種生長(zhǎng)迅速且易操作的體系內(nèi)部研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,避開了傳統(tǒng)的體外方法中實(shí)驗(yàn)條件對(duì)蛋白質(zhì)研究的不利影響,且無(wú)需體外純化蛋白、一次操作可分析大量基因編碼區(qū),靈敏度高,而且通過(guò)篩選基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)可以直接找到與誘餌蛋白相互作用蛋白的DNA序列。3.1轉(zhuǎn)錄激活蛋白的激活和恢復(fù)雙雜交系統(tǒng)的產(chǎn)生基于對(duì)酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4蛋白的認(rèn)識(shí)。天然Gal4分子是Gal1基因轉(zhuǎn)錄必需的蛋白質(zhì)因子,它由一條多肽鏈組成,含881個(gè)氨基酸。它有兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合域(DNA-BindingDomain,DNA-BD),由位于N-末端的147個(gè)氨基酸組成,功能是識(shí)別并結(jié)合位于Gal1基因的上游激活序列(UpstreamActivatingSequence,UAS);另一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(ActivatingDomain,AD),由位于C-末端的768~881個(gè)氨基酸構(gòu)成,負(fù)責(zé)RNA聚合酶復(fù)合體激活轉(zhuǎn)錄的功能。DNA-BD和AD對(duì)激活轉(zhuǎn)錄是必不可少的,二者之一單獨(dú)作用不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。研究表明,當(dāng)這兩個(gè)功能域位于不同肽鏈上,只要它們?cè)诳臻g上充分接近,即使是非共價(jià)結(jié)合也能夠恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性?；谏鲜鍪聦?shí),可以借助兩個(gè)能相互作用的蛋白質(zhì)為紐帶,將相互分開的DNA-BD和AD在空間上拉近,構(gòu)建一個(gè)融合的、具有功能的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。一般是將已知蛋白(常稱為誘餌蛋白,baitprotein或X蛋白)的基因與編碼DNA-BD的序列融合并在酵母中共表達(dá)產(chǎn)生融合蛋白Gal4-BD-Bait,同時(shí)將編碼未知蛋白(常稱為prey或Y蛋白)的基因與編碼AD的序列融合并在酵母中共表達(dá)產(chǎn)生另一融合蛋白Gal4-AD-prey,將以上兩個(gè)酵母株融合,如果兩個(gè)外源蛋白有結(jié)合活性,那么借助Bait和prey的連接使得Gal4-BD和Gal4-AD空間上靠近,恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄激活蛋白的活性,并激活報(bào)告基因。也可以將兩個(gè)分別構(gòu)建的質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化一個(gè)酵母株。目前有很多生物公司以試劑盒的形式提供酵母雙雜交系統(tǒng)。本系統(tǒng)的核心組成就是兩種分別用于構(gòu)建bait和prey融合蛋白的質(zhì)粒及相應(yīng)宿主酵母株。宿主酵母已經(jīng)過(guò)改造,除去了Gal4基因活性,并重組入新的報(bào)告基因。報(bào)告基因有顯色型的如LacZ、MEL,營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記基因一般為L(zhǎng)eu、His、Ade等,為了增加陽(yáng)性克隆的可信度,一般同時(shí)構(gòu)建幾個(gè)報(bào)告基因,不同報(bào)告基因之間是并聯(lián)關(guān)系,互不影響,可聯(lián)用,也可選用。不同的報(bào)告基因?qū)D(zhuǎn)錄激活蛋白的敏感度是不同的,而且有些報(bào)告基因有基底水平的表達(dá),遇到這種情況可用一些表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑減少背景。還有一種情況是,有些bait蛋白本身就有轉(zhuǎn)錄因子活性,這時(shí)就需要對(duì)其DNA序列進(jìn)行改造,酸性的兩親性結(jié)構(gòu)域傾向于有轉(zhuǎn)錄活性,不過(guò)改造也有可能除去誘餌蛋白的結(jié)合功能,需慎重。近年來(lái),酵母雙雜交系統(tǒng)在蛋白質(zhì)相互作用的研究中得到廣泛應(yīng)用,李凌云等利用本系統(tǒng)篩選出了麻疹病毒的絨猴細(xì)胞受體基因。本實(shí)驗(yàn)室正在用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選WSSV受體基因,我們以較易為WSSV感染的中國(guó)對(duì)蝦鰓組織為材料提取總RNA構(gòu)建一個(gè)cDNA文庫(kù),以WSSV的粘附蛋白(vriusattchmentprotion)VP39為誘餌構(gòu)建融合質(zhì)粒,將含誘餌質(zhì)粒的菌株與cDNA文庫(kù)融合并利用選擇性培養(yǎng)基篩選,最后分析陽(yáng)性克隆。3.2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展3.3.1雜交系統(tǒng)在研究細(xì)胞信號(hào)傳遞的過(guò)程中常涉及到第三個(gè)分子的作用,于是發(fā)展了三雜交系統(tǒng)。它的原理是,除利用了傳統(tǒng)的雙雜交系統(tǒng)中的兩個(gè)融合蛋白AD-prey和BD-bait外,還必須借助第三個(gè)分子的參與實(shí)現(xiàn)相互作用,第三個(gè)分子可以是蛋白質(zhì)、多肽、小分子配體、RNA等。3.3.2單混合系統(tǒng)單雜交系統(tǒng)用于檢測(cè)蛋白與DNA序列的相互作用,不再贅述。3.3.3雙向雙雜交和反向單雜交負(fù)選擇系統(tǒng)也叫反向選擇系統(tǒng),與正向選擇系統(tǒng)的區(qū)別在于其報(bào)告基因的誘導(dǎo)機(jī)制或表達(dá)結(jié)果不同:一種是當(dāng)報(bào)告基因被BD-X/AD-Y激活時(shí),表達(dá)產(chǎn)物直接或間接對(duì)宿主細(xì)胞有毒;另一種方式是在正向報(bào)告基因上游再引入一個(gè)含阻遏子的操縱元,當(dāng)BD-X/AD-Y有相互作用時(shí)則激活阻遏蛋白的轉(zhuǎn)錄,阻遏蛋白就會(huì)抑制報(bào)告基因的表達(dá)。反向雙雜交系統(tǒng)用于篩選蛋白突變體和確定能夠打破特異蛋白相互作用的試劑。反向單雜交系統(tǒng)用于分析DNA結(jié)合蛋白的突變或特異DNA序列突變對(duì)二者相互作用的影響。反向三雜交系統(tǒng)可用來(lái)研究?jī)蓚€(gè)已知蛋白相互作用的解離劑。3.3.4酵母雙雜交的基因表達(dá)傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)是由RNA聚合酶Ⅱ來(lái)轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因,而建立在RNA聚合酶Ⅱ激活轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)上的酵母雙雜交系統(tǒng)的不足是不能研究與激活因子或輔助激活因子的相互作用蛋白,因它本身就可激活報(bào)告基因的表達(dá),這也可能是酵母雙雜交系統(tǒng)存在假陽(yáng)性的原因之一。RNA聚合酶Ⅲ主要用來(lái)轉(zhuǎn)錄tRNA。在酵母菌株中通過(guò)改造,用RNA聚合酶Ⅲ替換RNA聚合酶Ⅱ,就可避免由于bait蛋白具有激活RNA聚合酶Ⅱ而導(dǎo)致報(bào)告基因表達(dá)的情況。3.3.5微生物及其產(chǎn)物酵母雙雜交系統(tǒng)的缺陷是不能研究高等生物中常見的需翻譯后加工的蛋白質(zhì)之間的相互作用,如磷酸化、甲基化、糖基化、二硫化等。VidalM建立的哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶為報(bào)告基因。其活性可在細(xì)胞提取物中檢測(cè)。該方法主要用于檢驗(yàn)已知蛋白的相互作用。3.3.6酵母膜的信質(zhì)元素以上介紹的幾種酵母雙雜交系統(tǒng),其蛋白的相互作用是發(fā)生在核內(nèi)的,但有些全長(zhǎng)的跨膜蛋白要么不能有效的轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中,或轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)去后,由于不能正確折疊或穩(wěn)定性差,使蛋白相互作用很弱或不能發(fā)生。因此對(duì)于研究膜蛋白含膜受體、分泌蛋白及胞質(zhì)蛋白等就有很大局限性。AronheimA等建立了應(yīng)用SOS招募系統(tǒng)(SOSRecruitmentsystem,SRS)。在SOS招募系統(tǒng)中,蛋白質(zhì)的相互作用被人為限制在酵母細(xì)胞膜上,該系統(tǒng)利用真核生物中普遍存在的ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑作為蛋白質(zhì)相互作用的選擇標(biāo)記。Ras是一個(gè)膜偶聯(lián)信號(hào)蛋白。在本系統(tǒng)中,利用酵母的溫度敏感株、在36°C不能生長(zhǎng)的Ras途徑突變體作為宿主,將人的SOS蛋白與Bait蛋白融合,Prey蛋白通過(guò)與豆蔻?；盘?hào)蛋白融合定位于膜上。若Bait與Prey能結(jié)合,則SOS蛋白就會(huì)被招募在細(xì)胞膜上并激活Ras蛋白,產(chǎn)生Ras途徑,使突變株在36℃可以生長(zhǎng)。4蛋白質(zhì)功能及相互作用蛋白質(zhì)芯片是在后基因組時(shí)代為闡明基因組計(jì)劃中測(cè)定的許多不明功能序列的基因的作用而發(fā)展的新技術(shù),與研究蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)生化技術(shù)相比,其優(yōu)點(diǎn)是高通量,微型化。蛋白質(zhì)芯片可以點(diǎn)陣排列的方式在很小的片基上有序的集成多種蛋白質(zhì)活性分子(配基),利用微量生理或生物采樣,可以同時(shí)檢測(cè)和研究不同蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)芯片是一種用于蛋白質(zhì)組水平研究的理想方法。目前已開發(fā)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),一種是建立在橢偏成像原理基礎(chǔ)上的光學(xué)生物分子分析技術(shù),通過(guò)在芯片表面上由蛋白之間的相互作用引起的蛋白薄層厚度的變化,利用橢偏分析與快速電子攝像技術(shù)顯示蛋白分子之間的相互作用,具高空間分辨率、快速取樣和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。由此又衍生了活性探針及光學(xué)多元蛋白芯片技術(shù)。另一種是用載玻片制作的熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)芯片,此芯片的技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是易于實(shí)現(xiàn),用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備就能做到。同DNA分子相比,蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其生物活性與空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān);蛋白質(zhì)不能被簡(jiǎn)單的擴(kuò)增或原位合成,難以利用拷貝增加的方式來(lái)提高檢測(cè)的靈敏度;其次,蛋白質(zhì)的相互作用無(wú)序列可循,而是類似于抗原-抗體的特異結(jié)合作用;另外,在操作過(guò)程中,蛋白質(zhì)很容易變性。因此,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)在具有巨大的發(fā)展?jié)摿Φ耐瑫r(shí),它的開發(fā)難度也是很大的。5yfp和cfp的相互作用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)利用了綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)及其突變體做為融合標(biāo)記物來(lái)指示蛋白之間的相互作用,當(dāng)兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí),供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài),在該電子回到基態(tài)前,通過(guò)偶極子相互作用,實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移(即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移)。以GFP的兩個(gè)突變體藍(lán)綠色熒光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)、黃色熒光蛋白(yellowfluorescentprotein,YFP)為例簡(jiǎn)要說(shuō)明其原理:CFP的發(fā)射光譜與YFP的吸收光譜有相當(dāng)?shù)闹丿B,當(dāng)它們足夠接近時(shí),用CFP的吸收波長(zhǎng)激發(fā),CFP的發(fā)色基團(tuán)將會(huì)把能量高效率地共振轉(zhuǎn)移至YFP的發(fā)色基團(tuán)上,所以CFP的發(fā)射熒光將減弱或消失,主要發(fā)射將是YFP的熒光。兩個(gè)發(fā)色基團(tuán)之間的能量轉(zhuǎn)換效率與它們之間的空間距離的6次方成反比,對(duì)空間位置的改變非常靈敏。例如要研究?jī)煞N蛋白質(zhì)a和b間的相互