聚乙二醇化重組人粒細胞集落刺激因子的藥動學研究

重組人骨髓聚集刺激因子（rhg-csf）是治療腫瘤放射化療引起的中性細胞減少的有效藥物。它具有提高血容量中粒徑含量的功能，在傷口移植中得到了廣泛應用。但其半衰期短,需要每日給藥。聚乙二醇(PEG)化重組人粒細胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF)是通過基因重組技術(shù)生產(chǎn)的PEG化多肽類一類新藥,是將相對分子質(zhì)量為20000的單鏈PEG共價偶聯(lián)到rhG-CSF的N末端氨基上而形成的長效制劑。PEG本身沒有明顯的生物活性,PEG-rhG-CSF與rhG-CSF作用機制相同,都是與細胞表面特異性受體結(jié)合,促進骨髓造血干細胞的分化和增值,但PEG化后的rhG-CSF降低腎清除并延長藥物在體內(nèi)持續(xù)時間。本實驗研究了癌癥患者化療后48h單次sc不同劑量的PEG-rhG-CSF,用酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測藥后不同時間血液中的藥物濃度變化,以進行臨床藥動學研究,為臨床合理用藥提供實驗依據(jù)。1耐藥患者和藥動學1.1藥品與試劑:PEG-rhG-CSF質(zhì)控樣品,無色透明液體,每支0.5mL,150μg/mL,HPLC測質(zhì)量分數(shù)為99.8%,批號20030201,由山東格蘭百克生物制藥有限公司提供。樣品試驗前于4℃保存。檢測PEG-rhG-CSF的ELISA試劑盒,購自美國Biosource公司。1.2儀器:Model550型酶標微板讀數(shù)儀(美國Bio-Red公司);Columbus洗板機(奧地利Tecan公司)。1.3受試患者:16例住院癌癥患者(中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院),男女各8例,經(jīng)組織病理學或細胞學確診為非小細胞肺癌或乳腺癌(其中14例非小細胞肺癌,2例乳腺癌),年齡35~65歲(中位年齡50歲),用藥前的基礎中性粒細胞2.11×109~10.42×109/L(中位值5.84×109/L)。既往未接受過化療或放療,KPS功能狀態(tài)評分標準(Karnofsky,KPS)≥60分,預計生存期3個月以上,骨髓無腫瘤轉(zhuǎn)移,造血功能和外周血常規(guī)正常,無出血傾向,無明顯心、肝、腎功能異常,自愿受試,簽署知情同意書。1.4給藥及采血方法:患者化療結(jié)束后48h單次sc給予PEG-rhG-CSF,劑量分別為30、60、100、200μg/kg,每組4例病人。于給藥前和給藥后不同時間從前肢肘窩靜脈取血,每次5mL。取血時間點為0d(藥前)、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、18d(藥后)。血液在室溫放置30min后,4000r/min離心15min,分離出血清,-20℃保存待測(血清樣品由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院提供)。1.5ELISA法測定血藥濃度:在預包被第一抗體的96微孔板上,孔內(nèi)加入樣品(標準品或待測樣品)和生物素化第二抗體各50μL(標準品100μL),輕輕混勻20s后于37℃保溫2h。除去孔內(nèi)液體,洗板4次,每次3min,除凈孔內(nèi)殘液后每孔加100μL鏈親和素-辣根過氧化物酶,室溫放置0.5h。洗去并除凈孔內(nèi)殘液后,每孔加100μL底物液TMB(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺),室溫反應0.5h后加100μL硫酸終止反應。在酶標儀450nm處讀取各孔的吸光度(A)值。1.6數(shù)據(jù)處理及藥動學參數(shù)計算:血藥濃度-時間數(shù)據(jù)用3P97藥動程序擬合分析并計算藥動學參數(shù);采用梯形法計算AUC值,tmax和Cmax采用實測值;實驗數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示。2結(jié)果2.1血清中peg-rhen-csf的表達分別用藥盒中提供的rhG-CSF標準品和本實驗中PEG-rhG-CSF的質(zhì)控樣品制備標準曲線。rhG-CSF的終質(zhì)量濃度為0、39、78、156、312、625、1250、2500pg/mL,PEG-rhG-CSF的終質(zhì)量濃度為0、78、156、312、625、1250、2500、5000pg/mL。在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi),藥物質(zhì)量濃度對數(shù)與吸光度值對數(shù)呈直線相關,回歸方程分別為lgA=-2.636+0.902×lgC,r=0.9987(rhG-CSF)和lgA=-2.850+0.869×lgC,r=0.9979(PEG-rhG-CSF),經(jīng)平行性測驗表明,兩條標準曲線平行相關(P>0.05)。本試驗最低定量限為標準曲線的最低質(zhì)量濃度點,即78pg/mL。在100~4000pg/mL質(zhì)量濃度,測定血清中PEG-rhG-CSF的板內(nèi)RSD為6.6%~9.6%,平均準確度96%~105%;板間RSD為6.3%~10.2%,平均準確度為99%~100%。結(jié)果見表1。另外,該藥盒為IL-2、IL-3、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α等多種細胞因子均無明顯的交叉反應。以上各項條件均能滿足藥動學的實驗要求。2.2血清中藥物的量測定PEG-rhG-CSF的定量測定:按照測定方法項下規(guī)定的方法測定,每次測定均制備1條標準曲線以計算血清中藥物的量。癌癥患者化療后48h分別單次sc給予PEG-rhG-CSF30、60、100、200μg/kg后的平均血藥濃度-時間曲線見圖1。2.3計算和分析藥代動力學參數(shù)血藥濃度試驗數(shù)據(jù)用3P97藥代計算程序進行處理。經(jīng)擬合優(yōu)度分析,藥物消除符合一房室模型,具體藥動學參數(shù)見表2。3討論3.1標準曲線的測定藥盒:本實驗所用ELISA藥盒中的兩株抗體是針對天然和重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的單克隆抗體組成,用藥盒提供的標準品rhG-CSF作標準曲線能很好地重復出藥盒說明書上的數(shù)據(jù),標準品濃度的對數(shù)與吸光度值對數(shù)呈直線相關;但用該藥盒測定本研究提供的PEG-rhG-CSF,相同質(zhì)量濃度下所測定的A值均偏低,這可能與PEG大分子影響了抗rhG-CSF抗體的親和力有關,造成對PEG-rhG-CSF結(jié)合靈敏度的降低;但基于兩條標準曲線平行相關,說明該藥盒沒有改變測定rhG-CSF的本質(zhì),可以用于測定樣品中的PEG-rhG-CSF。每次試驗均用PEG-rhG-CSF質(zhì)控樣品制備標準曲線,從而確保了血藥濃度測定的準確性。另外,本方法的精密度和準確度,最低定量限以及特異性均能符合新藥藥動學的試驗要求。3.2單次sc給予peg-rhen-csf的單次給藥后血藥濃度變化病人sc給予PEG-rhG-CSF后,4個劑量組的消除相半衰期(t1/2ke)差異不大,組間平均半衰期為47.0h(44.6~49.8h);Cmax和AUC隨給藥劑量的增大而增大,CL隨劑量增大有降低的趨勢,tmax在30~100μg/kg劑量范圍內(nèi)基本一致,而高劑量組200μg/kg則明顯延長。病人化療后48h單次sc給予PEG-rhG-CSF100μg/kg后血藥濃度變化與中性粒細胞提升的關系如圖2所示,化療后病人先經(jīng)歷3d由于化療而自身動員中性粒細胞的升高期后,從化療后第3天(給藥次日)起開始下降,到化療后第6天(藥后4d)降到低谷(3.00×109/L),該期間血液中PEG-rhG-CSF一直維持在較高的質(zhì)量濃度;藥后5~7d中性粒細胞開始持續(xù)上升,在第7天達峰值11.59×109/L;此時PEG-rhG-CSF的血藥濃度開始很快下降,提示PEG-rhG-CSF在血液中的清除受中性粒細胞的介導,這與非PEG化的rhG-CSF主要是通過腎小球濾過被清除的機制不盡相同,該結(jié)果與文獻報道基本一致。3.3peg-rhen-csf化rhG-CSF比較:津恤力是山東格蘭百克生物制藥有限公司上市的非PEG化的rhG-CSF產(chǎn)品,其血液消除半衰期為3.5h,血液清除率為30mL/(h·kg),臨床上用5μg/kg的劑量,需要每天注射1次;PEG化后的本品在血液中的清除半衰期明顯延長(平均半衰期為47.0h),清除率明顯減慢[平均清除率為4.29mL/(h·kg)]。根據(jù)文獻報道,當PEG-rhG-CSF劑量為100μg/kg時,一周只需要sc1次,就可以達到持續(xù)升高中性粒細胞的臨床效果;與每天注射5μg/kg的rhG-CSF,連續(xù)注射1周的效果相同。本實驗結(jié)果也證明了這一長效作用。3.4單次scpegfilgrastim結(jié)果比較:Pegfilgrastim(PEG化重組人粒細胞集落刺激因子)是美國Amgen公司的同類產(chǎn)品。據(jù)文獻報道,3例臨床非小細胞肺癌病人化療后24h按100μg/kg劑量單次scPegfilgrastim后的平均半衰期為33.2h(30.3~53.8h),平均清除率為14.0mL/(h·kg)[4.2~15.