植物抗害蟲(chóng)的間接防御萜類化合物在植物間接防御中的作用

害蟲(chóng)和疾病是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素。對(duì)于蟲(chóng)害,人們?cè)诤荛L(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)認(rèn)為,植物采取分泌各種毒素、阻食劑的方法來(lái)抵御蟲(chóng)害,如蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑、植物凝集素和幾丁質(zhì)酶等。其他來(lái)源的抗蟲(chóng)物質(zhì),如來(lái)自微生物的蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)殺蟲(chóng)晶體蛋白、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白、異戊烯轉(zhuǎn)移酶等和來(lái)自動(dòng)物的昆蟲(chóng)毒素、咽側(cè)體靜體激素等都是直接作用于害蟲(chóng)的“直接防御”方式。十多年前荷蘭和美國(guó)的學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)某些植物在受到蟲(chóng)害后會(huì)釋放有機(jī)揮發(fā)化合物以吸引天敵,此后人們對(duì)植物防御蟲(chóng)害的模式有了新的認(rèn)識(shí)。這種吸引天敵來(lái)消滅害蟲(chóng)的“間接防御”已在多種植物中發(fā)現(xiàn),被有機(jī)揮發(fā)化合物吸引的天敵以捕食和寄生兩種方法消滅害蟲(chóng)。這些有機(jī)揮發(fā)物中以萜類居多,因此人們把目光聚集于這一類尚未完全了解的次生代謝物上。1昆蟲(chóng)和其他類化合物產(chǎn)生的因素昆蟲(chóng)危害是誘發(fā)萜類物質(zhì)的主要因素,外源施加的茉莉酸和茉莉酸甲酯也能引起萜類物質(zhì)的釋放,而且不同植物可能由不同的因素誘導(dǎo)。1.1特殊的有機(jī)溶劑最初研究者認(rèn)為,植物發(fā)動(dòng)“間接防御”是由昆蟲(chóng)咬食造成的機(jī)械損傷所引起,然而隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)口腔內(nèi)的分泌物在誘發(fā)“間接防御”中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用,這些來(lái)自昆蟲(chóng)口腔的分泌物主要是脂肪酸–氨基酸軛合物、脂肪酸、酶和多肽類的物質(zhì)。最早在甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)幼蟲(chóng)口腔分泌物中分離的化合物N-(17-羥基-亞麻?；?-L-谷氨酰胺[N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine,簡(jiǎn)稱volicitin],能誘導(dǎo)受到機(jī)械損傷的玉米幼苗釋放芳樟醇、(E)-β-法尼烯、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(E)-橙花叔醇、吲哚等揮發(fā)性化合物,吸引寄生蜂。在南美沙漠蝗中發(fā)現(xiàn)的caeliferins是一類非鱗翅目激發(fā)子,它們是含有15～20碳的脂肪酸,其中16碳的同型物最能誘導(dǎo)揮發(fā)物的釋放,當(dāng)玉米幼苗用5μlcaeliferins處理后,其效果與用100pmol的volicitin處理和害蟲(chóng)咬食2h基本相同,可以誘發(fā)吲哚、單萜、倍半萜以及它們11碳和16碳的同系物。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)除了具有纖維素的糖化作用外,還與萜烯類化合物揮發(fā)有密切聯(lián)系。菜粉蝶(Pierisbrassicae)幼蟲(chóng)口腔分泌物中的β-葡萄糖苷酶可直接作用于糖苷上,誘導(dǎo)甘藍(lán)萜類揮發(fā)物的釋放,成為激發(fā)萜類物質(zhì)產(chǎn)生的激發(fā)子。N-酰氨酸廣泛存在于昆蟲(chóng)口腔分泌物中,作為取食的表面活化劑,由昆蟲(chóng)腸道內(nèi)的一系列微生物合成,Spiteller等從甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassicae)和地老虎(Agrotissegetum)的口腔分泌液中鑒定出10種菌株,它們能把不同長(zhǎng)度、飽和度的脂肪酸合成典型的鱗翅目N-酰氨酸。最近在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)口腔分泌液中發(fā)現(xiàn)的inceptin,來(lái)自于葉綠體ATP合成酶亞基γ-亞基的調(diào)節(jié)區(qū)域,能引起植物釋放乙烯、水楊酸和茉莉酸。1.2br多態(tài)性激發(fā)子植物群落松葉蜂(Diprionpini)的輸卵管分泌物可以誘發(fā)萜類物質(zhì)釋放,但具體的激發(fā)子是什么目前還不清楚。有意思的是,從兩種豆象(Bruchuspisorum和Callosobruchusmaculates)產(chǎn)卵液中鑒定的激發(fā)子Bruchins,包括豆象素B、C和D,它們可以在很低的濃度(1fmol)下刺激鰲生性組織在未受損的菜豆葉中形成,抬高卵的位置,延長(zhǎng)初孵幼蟲(chóng)進(jìn)入菜豆的時(shí)間,使卵更長(zhǎng)時(shí)間暴露在天敵和干燥的環(huán)境中。1.3植株侵害率測(cè)定單純的物理?yè)p傷或沒(méi)有被害蟲(chóng)侵害的植株一般不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的萜類物質(zhì),在其它的一些三級(jí)體系(植物—昆蟲(chóng)—天敵)中,未受害的植株上空也發(fā)現(xiàn)了萜類物質(zhì),但其含量明顯少于被侵害的植株。當(dāng)在物理?yè)p傷處施加昆蟲(chóng)口腔分泌物、輸卵管分泌物或茉莉酸等物質(zhì)時(shí),揮發(fā)物的組成和含量才會(huì)有明顯的變化,而Mithofer等采用“機(jī)械昆蟲(chóng)”模仿?；页嵋苟?Spodopteralittoralis)對(duì)利馬豆(Phaseoluslunatus)咬食所產(chǎn)生的損傷(包括物理形態(tài)和持續(xù)時(shí)間),可誘發(fā)相似組分但某些組分含量不同的揮發(fā)物,損傷水平與脂肪酸來(lái)源的揮發(fā)物、單萜呈線性關(guān)系,但與其他萜類、甲基水楊酸不呈線性關(guān)系,他們認(rèn)為物理?yè)p傷的作用受到低估。1.4ja和meha對(duì)植物抗蟲(chóng)的誘導(dǎo)茉莉酸(Jasmonicacid,JA)及其衍生物是一類可以激活一系列植物抗蟲(chóng)防衛(wèi)反應(yīng)的重要內(nèi)源信號(hào)分子,當(dāng)植物受到機(jī)械傷害和病蟲(chóng)危害時(shí),體內(nèi)茉莉酸和茉莉酸甲酯(Methyljasmonate,MeJA)會(huì)迅速積累,而且外源施加的JA和MeJA也可以誘導(dǎo)植物抗蟲(chóng)反應(yīng)。它們主要通過(guò)兩種途徑誘導(dǎo)防御反應(yīng),一是與受體、細(xì)胞膜結(jié)合后,經(jīng)由硬脂酸途徑合成JA、MeJA,激活防御基因,二是與受體、細(xì)胞膜結(jié)合后直接激活防御基因。一般說(shuō)來(lái),JA在中等濃度時(shí)活性較高,據(jù)報(bào)道,1nmol/L的JA和1μmol/L的MeJA就能誘導(dǎo)植物基因表達(dá)水平的變化。2激活類合成酶基因,激活類合成酶基因植物受到蟲(chóng)害后,接收體外的誘導(dǎo)信號(hào),在體內(nèi)傳遞并放大,通過(guò)激活萜類合成酶基因合成萜類合成酶,從而促進(jìn)萜類的合成并釋放。這些過(guò)程受到一系列復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)控。2.1ja植物的外源信號(hào)分子對(duì)于外源信號(hào)是如何在植物體內(nèi)接收的研究相對(duì)較少,目前只有關(guān)于volicitin結(jié)合蛋白的報(bào)道,該結(jié)合蛋白存在于質(zhì)膜上,與volicitin的結(jié)合具有高度親和性、飽和性和可逆性,可以特異性地區(qū)分L-/D-volicitin對(duì)映體,而且MeJA處理植物后可提高其結(jié)合能力。外源信號(hào)接收后可通過(guò)膜電位或者植物體內(nèi)的其他內(nèi)源信號(hào)分子傳遞。植物被害蟲(chóng)取食后,在取食部位立即產(chǎn)生一個(gè)動(dòng)作電位,這個(gè)動(dòng)作電位能在短時(shí)間內(nèi)傳遍整個(gè)植株,引起膜電位變化,隨后胞內(nèi)的Ca2+濃度增加,蛋白激酶被激活,并產(chǎn)生與防御反應(yīng)有關(guān)的植物激素,最后由多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其相互作用調(diào)控被害植株的系統(tǒng)防御反應(yīng)。植物體內(nèi)的內(nèi)源信號(hào)分子包括系統(tǒng)素(systemin)、十八烷酸(ODA)、12-氧合植物二酸(12-OPDA)、茉莉酸、茉莉酸甲酯等。系統(tǒng)素能在植株損傷部位通過(guò)激活茉莉酸信號(hào)途徑來(lái)合成能夠長(zhǎng)距離傳遞的信號(hào)分子(如JA或OPDA),這些可移動(dòng)的分子在植物的未受害部位被相應(yīng)的膜受體所識(shí)別,隨后通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,誘導(dǎo)植株系統(tǒng)性地產(chǎn)生并釋放具有防御功能的化學(xué)物質(zhì)。2.2裸子植物群落的類合成酶基因萜類是植物次生代謝物中最為豐富的一類,對(duì)萜類合成酶及其編碼基因的研究也很多,如表1,在裸子植物(挪威云杉)和被子植物中都有發(fā)現(xiàn)萜類合成酶,被子植物中的單子葉植物(水稻、玉米)和雙子葉植物中也都鑒定出相應(yīng)的萜類合成酶及其基因,表達(dá)的部位以葉居多,也有在花和根中表達(dá),產(chǎn)物主要是揮發(fā)性的單萜和倍半萜。萜類合成酶擁有共同的進(jìn)化起源,根據(jù)其氨基酸序列的關(guān)系可以把其基因分為7個(gè)亞家族(TPSa到TPSg),其中TPSc、TPSe、TPSf與初級(jí)代謝相關(guān),而TPSa、TPSb、TPSd與次級(jí)代謝相關(guān)。與次級(jí)代謝相關(guān)的酶占了萜類合成酶的大多數(shù),被子植物中TPSa、TPSb居多,而裸子植物萜類合成酶獨(dú)成一支TPSd。萜類合成酶約含有550～850個(gè)氨基酸,分子量為50～100kDa,總的來(lái)說(shuō),單萜合成酶長(zhǎng)度為600～650個(gè)氨基酸,比倍半萜長(zhǎng)50～70個(gè)氨基酸,因?yàn)閱屋坪铣擅赴粋€(gè)質(zhì)體定位的信號(hào)肽,多數(shù)雙萜合成酶比單萜合成酶還要長(zhǎng)210個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度,因?yàn)槠渲写嬖谝欢伪Ｊ匦蛄?據(jù)推測(cè)該序列可能與環(huán)化相關(guān),具體機(jī)理尚不清楚。幾乎所有的酶都有富含天冬氨酸的DDxxD序列,此序列和二價(jià)金屬離子共同作用以結(jié)合底物。2.3ipp和dmac合成類植物萜類化合物的合成有兩條途徑,一是存在于胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑,由乙酰輔酶A縮合生成合成前體物質(zhì)異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲丙烯二磷酸(DMAPP),接著在FDP合成酶催化下生成法尼基二磷酸(FDP),最后合成倍半萜和三萜;二是存在于質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑,由丙酮酸和三磷酸甘油醛生成IPP和DMAPP,進(jìn)一步合成牦牛兒二磷酸(GDP)、牦牛兒牦牛兒二磷酸(GGDP),最后產(chǎn)生單萜和雙萜。雖然在不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)內(nèi)合成,萜類的合成一般為以下模式:合成IPP和DMAPP→合成萜類骨架前體(FDP、GDP和GGDP)→合成萜類骨架→產(chǎn)物的修飾。在合成IPP和DMAPP的過(guò)程中,胞質(zhì)和質(zhì)體中的前體物質(zhì)存在聯(lián)系,當(dāng)其中一條合成途徑受到阻礙時(shí),另外一條合成途徑將會(huì)起到補(bǔ)償作用,一些植物中的IPP和DMAPP都由MEP途徑合成,合成的IPP和DMAPP從質(zhì)體流到胞質(zhì)方向。萜類物質(zhì)主要從葉、根等的表皮細(xì)胞或分泌腺中釋放出來(lái),一般情況下,萜類物質(zhì)的釋放具有滯后性。損傷的早期主要釋放大量的脂肪氧合酶衍生的揮發(fā)性化合物,隨著為害的繼續(xù),早期階段釋放得很少的其它一些萜類物質(zhì)開(kāi)始增多,主要有(E)-羅勒烯、芳樟醇、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、(E)-法尼烯、(E,E)-法尼烯等。2.4非生物環(huán)境因子由于不同害蟲(chóng)的口器、取食方式不同,植物會(huì)做出不同的反應(yīng);而對(duì)于同一種害蟲(chóng)來(lái)說(shuō),不同的齡期、密度造成的危害程度不同也會(huì)使得相應(yīng)萜類物質(zhì)的釋放有所不同,如1齡期到4齡期粘蟲(chóng)(Pseudaletiaseparata)的幼蟲(chóng)誘導(dǎo)玉米產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能引誘寄生蜂,而被5齡期和6齡期幼蟲(chóng)侵害的玉米卻不能吸引害蟲(chóng)天敵;在利馬豆和黃瓜為材料的實(shí)驗(yàn)中,天敵更易被多害蟲(chóng)侵害的植株吸引,表明單一蟲(chóng)害和多重蟲(chóng)害會(huì)引起植物不同程度的響應(yīng)。植物的種類、品系、發(fā)育階段、受害部位、程度、持續(xù)時(shí)間等一系列因素也會(huì)影響后續(xù)萜類種類和含量的變化。玉米不同品種B73和Delprim會(huì)釋放出成分相同但含量不同的揮發(fā)性物質(zhì),因?yàn)樵谶@兩個(gè)品種中雖然都有基因tps4和tps5的位點(diǎn),但B73中的tps4有功能tps5無(wú)功能,而Delprim的情況正好與之相反。除了生物因素外,萜類的合成也受到非生物因素的影響。Gouinguene等的研究表明在干燥的土壤中,玉米幼苗相對(duì)釋放出更多的揮發(fā)物,最佳相對(duì)濕度為60%,最佳溫度為22～27℃;在黑暗中幾乎沒(méi)有揮發(fā)物的釋放,隨著光強(qiáng)的增加揮發(fā)物增加;施肥也是一個(gè)關(guān)鍵因素,當(dāng)營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí),釋放量會(huì)減少到最低。雖然在很多植物中已經(jīng)鑒定出萜類合成酶及其基因,但植物體內(nèi)接收外界各種信號(hào)的受體和信號(hào)傳導(dǎo)途徑,以及這些過(guò)程中所涉及到的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄、翻譯后調(diào)控還不是特別清楚。目前已有報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子有ORCA3和GaWRKY1,ORCA3是長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)中響應(yīng)JA的APETALA2(AP2)-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子,過(guò)表達(dá)ORCA3能夠提高生物代謝途中相關(guān)基因的表達(dá)水平,增加萜烯類吲哚生物堿的積累;在棉花(Gossypiumarboreum)中發(fā)現(xiàn)的GaWRKY1能夠調(diào)節(jié)δ-杜松烯合成酶(CAD1-A)的合成,在擬南芥中過(guò)表達(dá)GaWRKY1可以極大激活CAD1-A啟動(dòng)子活性[WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)在植物中發(fā)現(xiàn)的N端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,它能夠與(T)TGAC(C/T)序列即w-box發(fā)生特異性作用,調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中含有w-box元件的調(diào)節(jié)基因或/和功能基因的表達(dá),從而參與植物的各種防衛(wèi)反應(yīng)];另外,灰白楊(Populu×canescens[Aiton]Sm.)葉片中異戊二烯合成酶(PcISPS)的蛋白密度和酶活在夏末到達(dá)最高,PcISPS轉(zhuǎn)錄最高水平出現(xiàn)在初夏,秋季時(shí)蛋白水平不變而酶活下降,表明其酶活受到翻譯后調(diào)控,而且與其底物DMAPP水平密切相關(guān)。然而萜類合成與釋放的調(diào)控是一個(gè)極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程,目前人們所知道的只不過(guò)是其中很小的一部分,還有大量的研究工作需要進(jìn)行。3類化合物相關(guān)的基因檢測(cè)害蟲(chóng)天敵會(huì)順著植物釋放的一系列萜類物質(zhì)找到它們的獵物或寄主,從而消滅害蟲(chóng),避免植物受到進(jìn)一步傷害。Wei等利用氣相色譜-觸角電位儀(gaschromatography-electroantennographicdetection,GC-EAD)發(fā)現(xiàn),四季豆(Phaseolusvulgaris)受到2齡南美斑潛蠅(Liriomyzahuidobrensis)或美洲斑潛蠅(Liriomyzasativae)危害后,釋放的(3E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯,(3Z)-己烯醋酸鹽以及肟類化合物可明顯引起天敵離斑斑潛蠅繭蜂(Opiusdissitus)的觸角電圖反應(yīng),因此萜類、肟和綠葉氣體的混合物可能可以幫助天敵尋找到它們的目標(biāo)。單一萜類或者幾種萜類的混合物可以吸引天敵,萜類與其他某些物質(zhì)的混合物對(duì)天敵也有吸引作用,但混合物中各個(gè)物質(zhì)的具體作用機(jī)理還不是特別清楚。利用基因工程手段轉(zhuǎn)入外源萜類合成酶基因調(diào)控萜類化合物的合成,可以達(dá)到間接防御害蟲(chóng)的目的。轉(zhuǎn)入草莓芳樟醇/橙花叔醇合成酶FaNES1基因的擬南芥會(huì)釋放出4,8-二甲基-1,3(E),7-壬三烯和(3S)-(E)-橙花叔醇,通過(guò)Y-試管嗅覺(jué)測(cè)量計(jì)(olfactometerassay)檢測(cè)到害蟲(chóng)天敵智利小植綏螨(Phytoseiuluspersimilis)會(huì)選擇轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株;Schnee等在研究中采用六臂嗅覺(jué)測(cè)量計(jì),其中一臂的一端放置轉(zhuǎn)入玉米萜類合成酶tps10基因的擬南芥[釋放(E)-β-法尼烯、(E)-α-佛手柑油烯等],正對(duì)的另一臂放置野生擬南芥,其他四臂注入空氣,結(jié)果表明寄生蜂(C.marginiventris)絕大多數(shù)會(huì)選擇轉(zhuǎn)基因的擬南芥。研究證明,通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法可以有效的提高植物的間接防御水平,通過(guò)間接防御水平的提高并與直接防御相結(jié)合是一種新型的全方位的害蟲(chóng)防御策略。4對(duì)害蟲(chóng)的間接防御植物受到害蟲(chóng)危害后會(huì)釋放以單萜和倍半萜為主的萜類化合物來(lái)吸引害蟲(chóng)天敵,以達(dá)到消滅害蟲(chóng),避免進(jìn)一步傷害的目的,這種“間接防御”的方法能夠?yàn)橹参锉Ｗo(hù)提供一個(gè)新穎且環(huán)保的思路。植物蟲(chóng)害防治大多采用直接防御的辦法,目前研究