流動相離子強度對反相高效液相色譜峰形的影響

據(jù)統(tǒng)計，約80%的藥物含有堿性官能團，因此，堿性抗劑的逆相高效液相鉻（ep-hplc）的行為在鉻學術界是一個吸引人的研究主題。然而，具有不同父母準父母堿活性物質（ep-hplc）的分離重要性越來越受到重視。然而,由于堿性化合物的保留可隨著流動相pH值的不同而產(chǎn)生顯著的變化,因而它們的RP-HPLC分離通常具有一定的難度。在某些pH范圍內(nèi),堿性化合物的色譜峰拖尾,表觀柱效(理論板數(shù),n)較低,其原因可能包括色譜柱的過載、堿性化合物與填料表面殘余硅醇基的相互作用以及較慢的吸附-解吸附動力學等。絕大多數(shù)抗生素同時含有堿性和酸性基團,多為親水性的兩性化合物,故其RP-HPLC行為遠較通常的堿性化合物更為復雜。我們在應用現(xiàn)行各國藥典進行抗生素RP-HPLC分析時發(fā)現(xiàn),有些抗生素的色譜峰形異?！逍握箤挷⒔咏苯侨切?色譜峰的拖尾因子及峰寬均較大,有時甚至影響到被測物與有關物質間的分離。囿于目前的填料制造水平,以硅膠為基質的反相鍵合相填料的表面實際上是不均勻的,固定相中不可避免地含有少量高能量位點(sites),這些高能量位點易為可解離的(甚至中性的)化合物所過載(overloading)。此外,解離的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及較難滲透進入疏水性的固定相中也是可能的原因。眾多實驗結果已經(jīng)證實,在線性色譜(linearchromatography)領域,采用RP-HPLC分離可解離的(尤其是堿性的)化合物時色譜柱易于過載,甚至低達10ng(相當于10-6,進樣10μl)的堿性化合物也可使常規(guī)色譜柱(150mm×4.6mm)的表觀柱效明顯降低;減少進樣量則可改善色譜峰形并使表觀柱效顯著增加;過載效應可隨著流動相的離子強度(c)的增加而逐漸減弱。本課題選取了幾個具有代表性的抗生素品種,初步研究了流動相的離子強度對RP-HPLC中抗生素色譜峰形的影響。1lbkgelods-100s美國Agilent1100型HPLC儀。色譜柱:頭孢呋辛為美國DiscoveryC18(250mm×4.6mm,5μm),頭孢哌酮和青霉素G為英國HypersilBDSC18(250mm×4.0mm,5μm),克林霉素為日本TSKGELODS-100S(150mm×4.6mm,5μm)。頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢哌酮S異構體、頭孢哌酮降解物B、鹽酸克林霉素和青霉素G鉀對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。乙酸鈉、乙酸、氯化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氨水、甲酸鈉、甲酸、三乙胺、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸和高氯酸鈉均為分析純,乙腈和甲醇均為HPLC級,水為蒸餾水。應用PeakMaster5.1軟件(Charles大學)計算流動相的離子強度。2克林激素-a-cor-3,4-吡啶蘇-1,5,10.流動相的組成以及供試品液的濃度見結果與討論;檢測波長:頭孢呋辛和頭孢哌酮為254nm,克林霉素為214nm,青霉素G為220nm;柱溫30℃。流速:頭孢呋辛為1.5ml/min,頭孢哌酮為1.2ml/min,克林霉素和青霉素G為1.0ml/min。進樣體積:頭孢呋辛為20μl,頭孢哌酮、克林霉素和青霉素G為10μl。以流動相作頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮鈉和鹽酸克林霉素的溶劑,以水作青霉素G鉀的溶劑。3硅醇基的選擇已知在低pH值的流動相中,以所謂“B型”高純度硅膠為基質的反相鍵合相填料的表面幾乎不存在離子化的硅醇基,這使得殘余硅醇基對被測物的保留和過載行為的影響極小,故本課題主要采用這類金屬殘留量極低、酸性硅醇基含量最少的惰性填料——DiscoveryC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S。3.1色譜柱的選擇中國藥典(ChP)[2a]測定頭孢呋辛鈉中頭孢呋辛含量的RP-HPLC系統(tǒng)是參考美國藥典(USP)和英國藥典(BP)[3a,4a]制訂的,主要區(qū)別在于ChP選用C18柱代替USP規(guī)定的己基硅烷鍵合硅膠(C6)柱,而流動相則均為乙腈∶pH3.4乙酸鹽緩沖液(含5mmol/L乙酸鈉和0.1mol/L乙酸)(1∶10),頭孢呋辛(羧基的pKa值為2.5)在流動相中大部分呈解離狀態(tài)并荷負電。由于ChP規(guī)定采用較大的進樣量(0.5mg/ml,約1.1mmol/L,20μl),使頭孢呋辛峰具有典型的過載特征[5,6,7,8,9,10,11,12,14]——峰形接近直角三角形。隨著進樣量的增加,色譜區(qū)帶中高濃度(C)的前半部的保留時間(tR)相應減少,但色譜區(qū)帶均在同一時刻結束(Fig.1A,Tab.1)。這種色譜峰形在色譜學界通常稱之為過載拖尾(overloadtailing)或非線性拖尾(nonlineartailing)。過載使頭孢呋辛峰的拖尾因子(T)和峰寬均顯著增加,頭孢呋辛與有關物質間的分離也相應變差。另選用其他C18柱(KromasilC18、ZorbaxC18、InertsilODS-3、HypersilBDSC18、TSKGELODS-100S、ShimpackCLC-ODS和LiChrospher100RP18e)、C8柱(KromasilC8、InertsilC8-3、HypersilBDSC8、ShimpackCLC-C8、TSKGELC8和DiscoveryC8)和C4柱(SinoChromC4)實驗,結果也如此。如選用C6柱則可得最為對稱的色譜峰形,且頭孢呋辛峰無過載特征(Fig.1B)。國內(nèi)另有研究表明,頭孢呋辛的峰形與填料的品牌也即填料的制造工藝有關,選用某些品牌的填料如SpherisorbC18可得較為對稱的峰形,在我們的實驗中也得到證實。由此可見,雖然所用流動相的緩沖容量較低(乙酸的pKa值約為4.7[17a]),但頭孢呋辛在大多數(shù)類型的色譜柱上易于過載并非由于緩沖液過載(bufferoverload)所致,而可能源于這類色譜柱對離子化的化合物的飽和容量相對較低。最近的研究結果[7,8,9,10,11,12,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]顯示,應用RP-HPLC分離可解離的化合物時,流動相中添加緩沖鹽并非僅僅用于穩(wěn)定流動相的pH值,緩沖鹽、甚至簡單的中性鹽的反離子還可與離子化的被測物通過相互間的締合作用形成疏水性較強的中性離子對復合物;在低離子強度的緩沖液中,吸附在固定相表面的離子化的被測物分子的極性基團相互之間存在靜電排斥效應,這使得色譜柱的飽和容量顯著降低;隨著緩沖液濃度(離子強度)的增加,中性離子對復合物的濃度相應增加,固定相表面離子化的吸附物之間的相互排斥作用隨之減弱,導致色譜柱的飽和容量、尤其是填料上的低能量位點(與溶質和鍵合相的烷基鏈之間的相互擴散作用有關)的飽和容量以及平衡常數(shù)增加;鹽一類的流動相添加劑可破壞離子化的被測物在流動相中的溶劑化-去溶劑化平衡,產(chǎn)生所謂的促溶效應(chaotropiceffect),被測物與鹽相互作用,離子化的被測物相互間的排斥作用減弱,從而顯著地影響被測物在固定相上的吸附行為;在制備色譜系統(tǒng)中或被測物濃度較高時,流動相中應含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效果。根據(jù)文獻[8,9,10,11,12,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27],在流動相中添加中性鹽如氯化鈉或增加緩沖液的濃度(均使離子強度增加)后,頭孢呋辛的峰形顯著改善,拖尾因子降低,表觀柱效增加,其保留時間受進樣量的影響變小,且緩沖液的濃度越高,效果越明顯。有研究表明,色譜柱的飽和容量可隨緩沖鹽的單價陽離子(如Na+、K+、Cs+)直徑的增加而降低,故分別以NH+4、K+、Li+代替Na+進行了實驗。選用Na+,色譜柱的飽和容量相對較高。流動相中如含10%乙腈,則乙酸的pKa值可由4.7增至4.9;流動相的表觀pH值通?？呻S著乙腈濃度的增加而相應增加,且表觀pH值的變化與緩沖鹽的種類、濃度以及最初的pH值等均相關。顯然,現(xiàn)行藥典的流動相的緩沖容量較低,流動相中的乙酸只有極少量以解離的形式存在,如欲增加緩沖液的濃度,則緩沖液中需添加高濃度的乙酸,這使得乙酸可能作為強洗脫劑成分,改變色譜系統(tǒng)的選擇性。因此,緩沖鹽改用與乙酸性質類似但更為適宜的甲酸鹽(pKa值約為3.7[17b]),同時流動相進一步優(yōu)化為乙腈∶pH3.4甲酸鹽緩沖液(含80mmol/L甲酸鈉和0.14mol/L甲酸)(1∶9),則可得較好的色譜峰形(Fig.1C)。另用其他C18柱(KromasilC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S)實驗,亦可得顯著改善的色譜峰形。眾所周知,保留值(如容量因子k)反映了被測物在固定相和流動相中的量之比,故過載行為對保留值較大的組分更易于發(fā)生。實驗結果也證實,隨著流動相中乙腈濃度的增加,頭孢呋辛的保留時間減少,色譜峰的對稱性進一步改善(乙腈濃度為15%時,理論板數(shù)不增反降則是由于保留時間較少時,表觀柱效受柱前死體積的影響相對較大所致)。3.2色譜系統(tǒng)平衡所需時間的穩(wěn)定性ChP[2b]測定頭孢哌酮鈉中頭孢哌酮含量的RP-HPLC系統(tǒng)是參考USP[3b]制訂的,ChP和USP的流動相均為乙腈∶pH4.4乙酸鹽緩沖液(含1.2mmol/L三乙胺和4mmol/L乙酸)(12∶88);BP[4b]的流動相為乙腈∶pH4.4乙酸鹽緩沖液(含2.5mmol/L三乙胺和6mmol/L乙酸)(11∶89)。ChP采用較大的進樣量(0.5mg/ml,約0.7mmol/L,10μl),頭孢哌酮及其S異構體的色譜峰均具有典型的過載特征,降解物B(中性化合物)的峰形則非常對稱(Fig.2A)。另選用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3、TSKGELODS-100S和LiChrospher100RP18e)實驗,結果也如此。國內(nèi)許多實驗室證實,ChP方法對色譜柱的要求比較苛刻,即使降低進樣量也僅有少數(shù)品牌的色譜柱符合國外藥典對系統(tǒng)適用性的要求(USP:T≤1.5,BP:n≥5000);選用BP流動相則色譜柱的選擇范圍相對較寬;ChP色譜系統(tǒng)的平衡所需時間較長;采用某些品牌的色譜柱,頭孢哌酮的保留時間的重現(xiàn)性較差;選用不同品牌的填料,頭孢哌酮及其主要雜質的洗脫順序可能不同。三乙胺在HPLC早期主要作為掃尾劑以改善色譜峰形,隨著最近十多年來填料制造工藝的改進以及所謂惰性填料的廣泛應用,三乙胺在現(xiàn)代HPLC中已很少采用。三乙胺在ChP色譜系統(tǒng)中還可作為疏水性較弱的離子對試劑影響頭孢哌酮的保留,隨著流動相中三乙胺濃度的增加,頭孢哌酮的保留時間相應減少。流動相中離子對試劑的濃度一般應不低于5mmol/L,否則色譜系統(tǒng)的平衡所需時間較長,且離子化的化合物的保留值的重現(xiàn)性可能較差。采用無緩沖液或緩沖容量極低的流動相時,可解離的化合物的色譜峰可隨著進樣量的增加而展寬甚至裂分。在含12%～18%乙腈的流動相中,乙酸的pKa值由4.7增至約5.1。顯然,ChP色譜系統(tǒng)的緩沖容量極低,緩沖液的濃度與供試品液的濃度接近,較高濃度的供試品液進入色譜系統(tǒng)后,頭孢哌酮在流動相中的二次化學平衡會導致色譜區(qū)帶處的流動相pH值發(fā)生微小變化,影響頭孢哌酮的可解離基團的離子化,即頭孢哌酮在色譜區(qū)帶的每一點處的離子化程度取決于其本身的濃度,而頭孢哌酮的不同離子化形式的保留是不同的,結果導致緩沖液過載——頭孢哌酮峰展寬,保留值重現(xiàn)性差。如采用1/10的進樣量,則頭孢哌酮的峰形顯著改善,但仍呈現(xiàn)過載特征,仍較難符合國外藥典的要求。在流動相中添加中性鹽后,頭孢哌酮的峰形顯著改善,拖尾因子和峰寬均降低,其保留時間受進樣量的影響變小,且鹽的濃度越高,效果越明顯。參考ChP2005和文獻,將乙酸鹽緩沖液的pH值降至3.0,雖然離子強度僅稍增加,但頭孢哌酮的峰形顯著改善,只是仍稍具過載特征(Fig.2B)。這是因為在含有乙腈的流動相中,化合物的酸性基團的pKa值會隨著乙腈濃度的增加而相應增加,故pH3.0時,頭孢哌酮的羧基[pKa值為2.3(/drug/01/010103.htm)]在流動相中的解離被抑制,吸附在固定相表面的、羧基解離的頭孢哌酮分子顯著減少,頭孢哌酮分子相互間的靜電排斥效應相應降低,使色譜柱的容量、表觀柱效以及頭孢哌酮的保留時間均隨之增加。鑒于ChP2005流動相的緩沖容量仍較低,流動相中的乙酸只有極少量以解離的形式存在,故緩沖鹽改用更為適宜的甲酸鹽,同時棄用會使保留機理復雜化的三乙胺,選用乙腈∶pH3.0甲酸鹽緩沖液(含40mmol/L甲酸鈉和0.18mol/L甲酸)(18∶82)為流動相時,可得較好的色譜峰形和分離效果(Fig.2C);隨著緩沖液濃度的進一步增加,色譜峰形進一步改善;甚至進樣量增加1倍,也未見拖尾因子和峰寬有顯著的增加。另用其他C18柱(KromasilC18、LiChrospher100RP18e、DiscoveryC18、HypersilBDSC18和TSKGELODS-100S)實驗,亦可得顯著改善的色譜峰形和分離效果。但值得注意并令人困惑的是,僅僅將乙酸鹽緩沖液的pH值降至3.0并添加約16mmol/LNaCl,卻可得最佳的色譜峰形。3.3流動相的離子強度ChP[2c]測定鹽酸克林霉素中克林霉素含量的RP-HPLC系統(tǒng)與BP和USP[3b,4b]不同,ChP的流動相為甲醇∶pH3.0磷酸鹽緩沖液(含25mmol/L磷酸二氫銨+4mmol/L磷酸)(45∶55),BP和USP的流動相為乙腈∶pH7.5磷酸鹽緩沖液(含50mmol/L磷酸二氫鉀和40mmol/L氫氧化鉀)(42∶58)。ChP采用與BP相同的進樣量,但克林霉素峰具有典型的過載特征(Fig.3A)。另選用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3、HypersilBDSC18、DiscoveryC18、Shim-packCLC-ODS和LiChrospher100RP18e)實驗,結果也如此。如選用BP的色譜系統(tǒng),則克林霉素的峰形較為對稱,表觀柱效亦較高(Fig.3B)。參考BP的色譜系統(tǒng),以甲醇代替乙腈,并適當增加甲醇的濃度以使克林霉素具有幾乎相同的保留時間,則流動相的離子強度減半,拖尾因子和峰寬僅稍增加;在ChP的流動相中添加中性鹽或緩沖液濃度增加1倍,拖尾因子顯著降低,但表觀柱效亦相應降低;如流動相的緩沖液濃度增加4倍,則峰形明顯改善,拖尾因子和峰寬均降低,但色譜峰仍具有過載的特征(Fig.3C);如緩沖液濃度增加4倍并以乙腈代替甲醇,同時適當減少乙腈的濃度,流動相的離子強度增加近6倍,但峰形卻未見顯著改善。上述實驗結果表明,克林霉素在固定相上的過載不僅僅與流動相的離子強度有關。在低pH值的流動相中,反相色譜柱易于為質子化的堿性化合物所過載;在色譜柱均過載的情形下,采用低pH值(pH2～3)流動相所得的色譜峰形明顯不同于采用高pH值(pH7)流動相所得的色譜峰形,后者的峰形更復雜,后者同時還具有明顯的指數(shù)拖尾(exponentialtailing)也即動力學拖尾(kinetictailing)的特征,提示在高pH值時除疏水相互作用外,還存在離子交換的相互作用;填料表面在高pH值流動相中出現(xiàn)陽離子交換位點,相應地增加了色譜柱的容量;流動相中反離子的化合價較高時(如BP流動相中的H2PO2?442-之于ChP流動相中的H2PO-4),反離子可與一個以上的有機離子形成中性離子對復合物,相應地減少了吸附在固定相表面的克林霉素分子及其相互間的靜電排斥效應,增加色譜柱的飽和容量。此外,流動相中選用不同的有機溶劑,有可能影響固定相的構象以及被測物在固定相表面的吸附和分配,導致不同的色譜峰形。由于在含有乙腈或甲醇的流動相中,堿性化合物的pKa值通?？呻S著有機溶劑濃度的增加而逐漸降低,故克林霉素(pKa值為7.6)在BP流動相中只有少量以質子化的形式存在,因而吸附在固定相表面的離子化的克林霉素分子極少,克林霉素分子相互間的靜電排斥效應較小,這使得色譜柱的飽和容量較高;克林霉素在ChP流動相中則全部是以質子化的形式存在的,故吸附在固定相表面的克林霉素分子均以離子化的形式存在,其相互間的靜電排斥效應較大,致使色譜柱的飽和容量相應較低。磷酸鹽(磷酸的pKa值為2.2,7.1,12.3[15c])在ChP流動相中主要以H2PO-4的形式存在。流動相中緩沖鹽的種類不同,則色譜柱的飽和容量、色譜峰形以及表觀柱效等均不相同;流動相中選用不同種類的無機反離子,質子化的堿性化合物峰的理論板數(shù)和拖尾因子均顯著不同,在已測試的四種反離子中,使拖尾因子降低、表觀柱效增加的趨勢如下:六氟磷酸根(PF-6)>高氯酸根(ClO-4)>四硼磷酸根(BF-4)>H2PO-4。向ChP流動相的緩沖液中添加0.1mol/LNaClO4,雖然流動相的離子強度僅增加3倍,但克林霉素峰的拖尾因子顯著降低,表觀柱效和保留時間亦顯著增加,唯克林霉素與緊鄰的未知雜質的分離度并未如預計地顯著增加,提示高濃度的ClO-4在該流動相中可能作為對離子改變了色譜系統(tǒng)的選擇性。3.4色譜峰峰行為USP[4d]測定青霉素G鉀中青霉素G含量的RP-HPLC系統(tǒng)與BP[3d]不同,USP的流動相為甲醇∶10mmol/L磷酸二氫鉀溶液(40∶60),BP的流動相則為甲醇∶pH3.5磷酸鹽緩沖液(80mmol/L磷酸二氫鉀+3mmol/L磷酸)(35∶65)。USP的進樣量是BP的進樣量的1/20,選用USP的流動相和進樣量,青霉素G峰形比較對稱,增加進樣量則峰形具有過載的特征(Fig.4A)。另選用其他C18柱(KromasilC18、InertsilODS-3和TSKGELODS-100S)實驗,結果也如此。改用BP的流動相,青霉素G峰形對稱且?guī)缀醪皇苓M樣量大小的影響。如將USP的流動相中的磷酸二氫鉀濃度增至50mmol/L,同時甲醇濃度增至50%,則峰形顯著改善,但仍稍具過載特征(Fig.4B);繼用磷酸調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的pH值至3.5,則峰形進一步改善(Fig.4C)。USP流動相中的磷酸二氫鉀溶液(pH4.3)非緩沖液,實為幾無緩沖容量的鹽溶液,易導致緩沖液過載,如進樣量較大則難以控制青霉素G在流動相中的解離即二次化學平衡,且流動相的離子強度較低,故色譜峰形隨著進樣量的增加而顯著展寬(Fig.4A)。將流動相中磷酸二氫鉀的濃度增至50mmol/L,增加了流動相的緩沖容量和離子強度,色譜峰形相應改善(Fig.4B);進一步調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的pH值至3.5,則流動相的緩沖容量顯著增加,且由于在含有乙腈的流動相中,化合物