小青龍湯對(duì)copd大鼠核因子b和-gcs的影響

小青龍湯是張仲景的《傷寒論》。它與麻黃、芍藥、細(xì)辛、干姜、甘草、桂枝、半夏、五味子一起配合。它可以解寒，水中飲用，肺氣恢復(fù)，自由釋放。臨床多用于治療慢性支氣管炎、過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺氣腫、肺心病以及慢性支氣管炎急性發(fā)作等呼吸系統(tǒng)疾病。本研究通過(guò)觀察小青龍湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病(COPD)寒痰蘊(yùn)肺型大鼠核因子κB(NF-κB)和γ-谷氨酰半胱氨酸合酶(γ-GCS)水平的干預(yù)作用,探討其治療COPD的機(jī)理。1材料和方法1.1龍湯大氣制劑動(dòng)物:健康雄性Wistar大鼠72只,體重200±20g,購(gòu)于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,SPF級(jí),隨機(jī)分為3組,即空白對(duì)照組24只、寒痰蘊(yùn)肺造模組24只、寒痰蘊(yùn)肺治療組24只。藥物與試劑:小青龍湯煎劑,藥物組成:麻黃9g,桂枝6g,白芍9g,干姜3g,五味子3g,半夏9g,甘草6g,細(xì)辛3g,水煎濃縮為濃度0.6g/ml的濃縮液,飲片由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供。通過(guò)流通蒸汽滅菌,4℃冰箱保存;指定品牌香煙;脂多糖(lipopolysaccharicle,LPS),產(chǎn)于美國(guó)Sigma公司O55:B5;戊巴比妥鈉,進(jìn)口分裝,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號(hào):F20020915;NF-κB一抗、γ-GCS一抗,購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器:AE200電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、ImageProPlu4.5圖像分析系統(tǒng)。1.2方法1.2.1大鼠的被動(dòng)吸煙染毒采用宋一平的方法并加以改良建立大鼠COPD模型。1.2.1.1在室溫環(huán)境中,第1、14天大鼠麻醉后氣管內(nèi)滴脂多糖:將大鼠逐一稱重,按50mg/kg體重腹腔注射濃度為0.4%戊巴比妥鈉溶液,待大鼠麻醉后,將其固定于解剖臺(tái)上,頭低位暴露聲門,將16號(hào)靜脈套管針沿氣管走行快速插入氣管,拔出針芯,接1ml注射器,1秒鐘內(nèi)注入溶于注射用生理鹽水的濃度為1mg/ml的脂多糖0.2ml(200μg),將大鼠直立,左右旋轉(zhuǎn),使脂多糖在肺內(nèi)均勻分布。1.2.1.2第2~28天給予大鼠每天2次香煙煙熏,每次點(diǎn)燃煙絲的重量為9.03g(每支煙煙絲重量為0.645g),持續(xù)時(shí)間大約1h,間隔4h(滴脂多糖當(dāng)天不煙熏)。被動(dòng)吸煙方法:將大鼠放入自制的有機(jī)玻璃染毒箱(100㎝×80㎝×50㎝)內(nèi),香煙點(diǎn)燃后,用60ml注射器吸滿煙霧,然后通過(guò)三通管將香煙煙霧快速注入染毒箱內(nèi)(此操作頻率為20次/分),進(jìn)行大鼠被動(dòng)吸煙染毒。為減少香煙燃燒所產(chǎn)的水蒸氣對(duì)大鼠的影響,在箱底放置適量硅膠干燥劑。1.2.1.3二次造模:第22天起大鼠放入-20℃冰箱里冷凍5min/d,連續(xù)8d。1.2.2灌胃治療組第30天起治療組大鼠每天給與2ml小青龍湯煎劑(相當(dāng)于成人劑量的7.5倍)灌胃治療,連續(xù)治療14d。造模組大鼠每天給與2ml生理鹽水灌胃?？瞻讓?duì)照組不做任何干預(yù),相同室內(nèi)環(huán)境下自由飲食飲水。1.2.3nf-b抗體的未血清學(xué)檢測(cè)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化。將切片放入0.01mol/LPBS中5~10min。取出,滴加3ml/L甲醇雙氧水孵育30min,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶。以PBS緩沖液震洗10min×3次后,入3ml/LTween20PBS孵育30min,同上洗滌。微波抗原修復(fù)。1∶100兔抗鼠NF-κB抗體(γ-GCS抗體為1∶150)(武漢博士德生物有限工程公司)于4℃過(guò)夜,30℃復(fù)溫1h,1∶500生物素化的羊抗兔IgG孵育2h,PBS震洗后,ABC復(fù)合物同上孵育,最后滴加DAB硫酸鎳銨加強(qiáng)顯色10~15min,PBS終止反應(yīng)。酒精梯度脫水、透明及中性樹膠封片后觀察。(實(shí)驗(yàn)中用正常兔血清和PBS緩沖液分別代替一抗作為陰性對(duì)照和空白對(duì)照。)胞核中表現(xiàn)為棕黃色為陽(yáng)性。每張切片選擇內(nèi)徑100~200μm的細(xì)支氣管、肺泡和小動(dòng)脈區(qū),數(shù)碼相機(jī)攝取圖像,輸入計(jì)算機(jī),同樣條件下攝入物鏡標(biāo)準(zhǔn)測(cè)微尺,應(yīng)用ImageProPlu4.5圖像分析系統(tǒng)采集和分析圖像并計(jì)算平均光密度值(即OD值平均光密度值與抗原含量呈正比關(guān)系,即光密度值越高,抗原含量越多,陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng))。統(tǒng)計(jì)方法:使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,運(yùn)用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,各組數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,結(jié)果顯示P<0.05、P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2-gcs表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,有大鼠陸續(xù)死亡,解剖尸體發(fā)現(xiàn)有1只為肺部生長(zhǎng)了巨大的膿腫日久導(dǎo)致呼吸衰竭所致,有3只為氣管滴注脂多糖時(shí)麻醉過(guò)量致死,1只為不明原因死亡。各組大鼠數(shù)量如下:空白對(duì)照組:24只;寒痰蘊(yùn)肺造模組:20只;寒痰蘊(yùn)肺治療組:23只。結(jié)果顯示:空白對(duì)照組支氣管和肺泡上皮細(xì)胞和小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞核中弱表達(dá)或不表達(dá),造模組γ-GCS在支氣管和肺泡上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及炎性細(xì)胞中都為高表達(dá)(P<0.01),經(jīng)過(guò)治療后,γ-GCS的陽(yáng)性表達(dá)率有明顯降低,其差異具顯著性(P<0.05)。γ-GCS光密度值測(cè)量(見表1)。與空白對(duì)照比較,▲P<0.01;與造模組比較,★P<0.05空白對(duì)照組支氣管和肺泡上皮細(xì)胞和小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞核中弱表達(dá)或不表達(dá),造模組NF-κB廣泛強(qiáng)表達(dá)于支氣管、肺泡上皮細(xì)胞和小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞核中,尤其支氣管上皮細(xì)胞核中表達(dá)最高,而治療組則表達(dá)明顯減弱,其差異具顯著性(P<0.05),見表2。與空白對(duì)照比較,▲P<0.01;與造模組比較,★P<0.053氧化應(yīng)激與gsh合成相關(guān)機(jī)理研究COPD是一組以持久性氣道阻塞性或氣流限制性或通氣障礙性為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病的統(tǒng)稱。其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,目前普遍認(rèn)為COPD是以氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥為特征,在肺的不同部位有肺泡巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加。激活的炎癥細(xì)胞釋放多種介質(zhì),破壞肺的結(jié)構(gòu)和(或)促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)。臨床上,寒痰蘊(yùn)肺型COPD癥狀表現(xiàn)為咳嗽氣喘,咳痰色白而清稀,遇冷則甚,胸膈滿悶,面色晦滯,畏寒肢冷,舌苔白滑,脈沉遲等。其治法為溫肺散寒,化痰利竅,故多以小青龍湯為主方治療。氧化、抗氧化失衡是導(dǎo)致COPD持續(xù)性慢性炎癥的重要因素。吸煙引起的氧化應(yīng)激,及繼之發(fā)生肺中炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)匯聚,產(chǎn)生外源性和內(nèi)源性ROS增多,是氧化應(yīng)激物質(zhì)的主要來(lái)源,導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)GSH減少,上皮細(xì)胞屏障功能喪失,滲漏性增加,氣道及肺泡損傷。提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑含量最簡(jiǎn)便的方法是直接補(bǔ)充抗氧化劑,如:維生素E、GSH及半胱氨酸等,但臨床報(bào)道指出療效多不理想。γ-GCS作為GSH的限速酶,有望通過(guò)對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)通路的了解進(jìn)而施加調(diào)控,增強(qiáng)γ-GCS活性,從而增加肺中GSH合成,為COPD的治療指出新的方向。核因子κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,不僅可以調(diào)控免疫細(xì)胞的激活、T、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育,還廣泛參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)。在COPD中,NF-κB可以通過(guò)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肺氣道上皮細(xì)胞中許多重要的炎性介質(zhì)基因的表達(dá),而參與肺部的炎癥、免疫反應(yīng)。且國(guó)內(nèi)外研究表明,氧化應(yīng)激與NF-κB等調(diào)控抗氧化因子的表達(dá)關(guān)系密切。其機(jī)制可能是,細(xì)胞在氧化應(yīng)激下,NF-κB等激活并核轉(zhuǎn)位,與γ-GCS基因啟動(dòng)子相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)mRNA轉(zhuǎn)錄,隨后γ-GCSmRNA進(jìn)入胞漿翻譯合成γ-GCS,催化GSH合成增加,參與抗氧化作用。本研究中,造模組免疫組化顯示γ-GCS和NF-κB