PAGE10PAGE3中國(guó)大鯢野外種群及棲息地調(diào)查技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了XX省行政范圍內(nèi)中國(guó)大鯢野外種群調(diào)查及棲息地調(diào)查的基本術(shù)語(yǔ)以及關(guān)于調(diào)查內(nèi)容、調(diào)查方法、調(diào)查成果、質(zhì)量控制、后續(xù)樣品處理等一般要求。本文件適用于對(duì)XX省行政范圍內(nèi)中國(guó)大鯢野外種群及棲息地的調(diào)查和快速評(píng)估。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB50707河道整治設(shè)計(jì)規(guī)范HJ710.8生物多樣性觀測(cè)技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無(wú)脊椎動(dòng)物HJ1167全國(guó)生態(tài)狀況調(diào)查評(píng)估技術(shù)規(guī)范-森林生態(tài)系統(tǒng)野外觀測(cè)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。樣線法Linetransects指按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求布設(shè)調(diào)查樣線，調(diào)查人員在調(diào)查樣線上行進(jìn)，觀察并記錄樣線兩側(cè)中國(guó)大鯢的個(gè)體數(shù)的調(diào)查方法。網(wǎng)籠陷阱法Traps是按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求布設(shè)網(wǎng)籠陷阱，根據(jù)網(wǎng)籠陷阱捕獲的個(gè)體數(shù)對(duì)中國(guó)大鯢野外種群進(jìn)行調(diào)查的方法。環(huán)境DNA（e-DNA）調(diào)查法EnvironmentalDNAsurvey按照標(biāo)準(zhǔn)方法采集中國(guó)大鯢棲息地水樣，經(jīng)抽濾后分離e-DNA，采用中國(guó)大鯢特異性引物的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序分析環(huán)境中中國(guó)大鯢的存在與否和數(shù)量的調(diào)查方法。問(wèn)卷調(diào)查法Questionnairesurvey是調(diào)查人員通過(guò)設(shè)置調(diào)查問(wèn)卷，有計(jì)劃地與當(dāng)?shù)乇辉L問(wèn)者直接進(jìn)行面對(duì)面的交流，獲取相關(guān)信息的方法。棲息地Habitat是指中國(guó)大鯢棲息的野外環(huán)境條件。主要由生物和非生物環(huán)境因子構(gòu)成，涵蓋了從水體到陸地的主要環(huán)境因子。調(diào)查內(nèi)容中國(guó)大鯢的種群數(shù)量（記錄表格見(jiàn)附錄A）中國(guó)大鯢的主要形態(tài)學(xué)性狀（記錄表格見(jiàn)附錄B）：包括性別、全長(zhǎng)、體重、尾長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、后肢長(zhǎng)、尾寬、眼間距、前臂及手長(zhǎng)、尾高、頭寬、鼻間距、眼徑、健康狀況、是否存在外部傷口、是否存在細(xì)菌或病毒感染、是否有寄生蟲(chóng)等中國(guó)大鯢棲息地的e-DNA分析記錄（記錄表格見(jiàn)附錄C）中國(guó)大鯢棲息地的主要環(huán)境因子（記錄表格見(jiàn)附錄D）：主要包括：經(jīng)緯度、海拔、河岸土地利用類型、氣溫、空氣濕度、河床類型、河流底質(zhì)、河寬、水深、水體流速、水體濁度、水溫、總磷、總氮、氨氮、總硬度、溶解氧、總堿度、水體pH、電導(dǎo)率、植被類型與蓋度、餌料生物。中國(guó)大鯢及其棲息地的受脅因素：包括道路建設(shè)、砂石采挖、涉水工程建設(shè)、農(nóng)牧漁業(yè)活動(dòng)、污染類型、污染強(qiáng)度、外來(lái)物種等調(diào)查方法河道選擇在開(kāi)展調(diào)查的縣市，通過(guò)與當(dāng)?shù)氐恼块T（如漁政，林業(yè)站，保護(hù)區(qū)等）聯(lián)系，也可采用訪問(wèn)調(diào)查或文獻(xiàn)調(diào)查的方式，篩選2-3條有中國(guó)大鯢潛在分布的河流進(jìn)行實(shí)地考察。選擇河流中最合適的、生境最佳的調(diào)查地點(diǎn)。每條河流確定調(diào)查樣線累計(jì)1公里（分別在河流的上、中、下游布設(shè)樣線），調(diào)查需選擇降雨少且水位低的時(shí)期（建議調(diào)查時(shí)間為每年的4月-6月，每條河流連續(xù)調(diào)查三天）以及流速緩慢的河段，因?yàn)楹恿魉康慕档蛯p少大鯢潛在的躲藏地點(diǎn)，增加發(fā)現(xiàn)的概率。野外調(diào)查需順著下游到上游的方向進(jìn)行，從而限制大鯢在被發(fā)現(xiàn)前逃逸下游的可能性。在調(diào)查開(kāi)始前，需在距起點(diǎn)0.5km處設(shè)置好安放器材及進(jìn)行測(cè)量和棉簽采樣的工作點(diǎn)。在每一條樣線的起點(diǎn)，填好野外實(shí)地調(diào)查記錄表。野外種群調(diào)查對(duì)每條河流的樣線法調(diào)查在天黑后進(jìn)行。在河流的上、中、下游分別設(shè)置1條樣線。大型河流（長(zhǎng)度>5km，河寬>5m）的樣線設(shè)置為長(zhǎng)500-1000m，寬離岸2m，小型河流（長(zhǎng)度<5km，河寬<5m）的樣線設(shè)置為長(zhǎng)200-500m，寬為整條河流的寬度。調(diào)查開(kāi)始后，3-4個(gè)調(diào)查者并排沿著河流由下游至上游方向，通過(guò)聚光照明涉水行進(jìn)。涉水需選擇水深<1m且透明度高的河道，在離岸0.5m的河道內(nèi)進(jìn)行。調(diào)查過(guò)程中需佩戴手套，調(diào)查人員需準(zhǔn)備好手抄網(wǎng)捕捉見(jiàn)到的大鯢個(gè)體。在較深且/或透明度較低的水體采用網(wǎng)籠陷阱法，該方法尤其適用于調(diào)查大鯢種群密度較低的地區(qū)。但需注意該方法在水溫<22°C時(shí)有效性高，水溫過(guò)高可能會(huì)影響捕獲率。網(wǎng)籠陷阱法布置的密度為3-5個(gè)網(wǎng)籠/樣線，放網(wǎng)時(shí)間為每日黃昏，收網(wǎng)時(shí)間為次日早上6點(diǎn)。誘餌可選擇雞腸，大片的豬肝和/或沙丁魚等，新鮮的誘餌可增加捕獲率。網(wǎng)籠陷阱法盡量不要在中國(guó)大鯢的繁殖季節(jié)使用，因?yàn)榇菩灾袊?guó)大鯢可能會(huì)在陷阱中產(chǎn)卵，而捕獲的雄性中國(guó)大鯢可能失去護(hù)巢行為。采用環(huán)境DNA（e-DNA）調(diào)查法進(jìn)行補(bǔ)充調(diào)查，在白天進(jìn)行。在樣線中水深>1m，流速<1m且有大石塊分布的點(diǎn)取e-DNA水樣，取樣點(diǎn)設(shè)置為3個(gè)/樣線。采用清潔劑清洗并用采樣點(diǎn)河水潤(rùn)洗過(guò)的容器（4-5L塑料瓶）取水體表面以下2-5cm的水樣4L。注意采樣人員需佩戴手套，且每次采樣需更換手套。每個(gè)點(diǎn)需取兩瓶水樣（備份樣品1個(gè)）。水樣需用0.45um的硝酸纖維濾紙（或玻璃纖維濾紙）在真空抽濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾（玻璃設(shè)備需提前高溫滅菌處理），濾膜保存在95%無(wú)水乙醇中用作后續(xù)分析（必要時(shí)可以更換濾膜，但所有濾膜均需保存在95%無(wú)水乙醇中）。采用問(wèn)卷調(diào)查法進(jìn)行補(bǔ)充調(diào)查，在每個(gè)村向至少10名當(dāng)?shù)厝肆私忾L(zhǎng)期以來(lái)大鯢種群數(shù)量的變動(dòng)以及棲息地受脅情況（記錄表格見(jiàn)附錄E）。形態(tài)學(xué)性狀測(cè)量、PIT標(biāo)記及遺傳背景樣品取樣對(duì)樣線法和網(wǎng)籠陷阱法采集到的個(gè)體編號(hào)并進(jìn)行形態(tài)學(xué)性狀測(cè)量、PIT標(biāo)記及遺傳背景樣品取樣。測(cè)量的形態(tài)學(xué)性狀包括1.全長(zhǎng)；2.頭寬；3.鼻間距；4.眼間距；5.眼徑；6.尾寬；7.尾高；8.尾長(zhǎng)；9.前肢長(zhǎng)；10.后肢長(zhǎng)；11.頭長(zhǎng)（圖2）。同時(shí)記錄個(gè)體的性別、健康狀況、是否存在外部傷口、是否存在細(xì)菌或病毒感染、是否有寄生蟲(chóng)等。個(gè)體性別通過(guò)泄殖腔進(jìn)行判斷；健康狀況、是否存在外部傷口、是否存在細(xì)菌或病毒感染、是否有寄生蟲(chóng)等通過(guò)對(duì)個(gè)體的外觀觀察進(jìn)行判斷。在進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量前，用帆布或毛巾對(duì)大鯢進(jìn)行簡(jiǎn)單的固定。一般情況下，全長(zhǎng)和尾長(zhǎng)采用軟尺進(jìn)行測(cè)量（不能采用鋼卷尺以防對(duì)其造成傷害）。其他形態(tài)學(xué)性狀采用帶電子讀數(shù)的游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量，單位為mm，精確到0.1mm（如個(gè)體過(guò)大時(shí)可用軟尺進(jìn)行測(cè)量）。體重采用便攜式鉤秤進(jìn)行測(cè)量，單位為g，精確到0.5g。需將個(gè)體放在防滑布中稱重，以免對(duì)其造成傷害。測(cè)量人員均需佩戴一次性橡膠手套，并在每次測(cè)量前更換。PIT電子標(biāo)簽統(tǒng)一打在大鯢左前肢腋下。遺傳背景樣品的取樣優(yōu)先采用無(wú)菌棉簽采集口腔粘液或體表粘液的方式，其次可采用剪尾低損傷取樣的方式。樣品采集后用95%的乙醇保存并對(duì)應(yīng)編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行遺傳背景分析。樣品采集完成后，將大鯢原地放歸。中國(guó)大鯢形態(tài)學(xué)測(cè)量示意圖棲息地調(diào)查棲息地調(diào)查和環(huán)境DNA（e-DNA）調(diào)查法取樣均在白天進(jìn)行。在調(diào)查河流的1km樣線測(cè)量9個(gè)點(diǎn)的棲息地微生境環(huán)境因子（上、中、下游各3個(gè)點(diǎn)）。其中經(jīng)緯度和海拔用GPS測(cè)定；河床類型參考GB50707進(jìn)行分類；河寬和水深結(jié)合人為估算、卷尺和激光測(cè)量的方法；底質(zhì)分類參照HJ710.8的規(guī)定；水體流速采用流速計(jì)進(jìn)行測(cè)量；森林類型參照HJ1167進(jìn)行劃分；河岸土地利用類型分為四種（即河岸兩側(cè)無(wú)耕作土壤，營(yíng)養(yǎng)豐富；河岸一側(cè)無(wú)耕作土壤，另一側(cè)為耕作土壤；河岸兩側(cè)耕作土壤；河岸兩側(cè)為耕作廢棄的裸露的風(fēng)化土壤層，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很少）；餌料生物按其豐富程度分級(jí)為高、中、低三個(gè)等級(jí)；水質(zhì)指標(biāo)（水溫、濁度、電導(dǎo)率、pH、溶解氧、總硬度、總堿度、總氮、總磷、氨氮等）采用便攜式水質(zhì)儀直接測(cè)量或現(xiàn)場(chǎng)采樣送檢的方式進(jìn)行測(cè)定（詳見(jiàn)附錄D）。 根據(jù)調(diào)查地的真實(shí)情況，記錄中國(guó)大鯢野外種群的受威脅程度。對(duì)調(diào)查點(diǎn)的道路建設(shè)、砂石采挖、涉水工程建設(shè)、農(nóng)牧漁業(yè)活動(dòng)、污染、外來(lái)物種等影響程度分級(jí)（強(qiáng)、中、弱、無(wú)；詳見(jiàn)附錄D）。原始記錄范圍和載體原始記錄應(yīng)包括野外記錄和實(shí)驗(yàn)室記錄兩部分。野外記錄包括調(diào)查記錄表、照片、視頻、原始圖件等。調(diào)查記錄表需涵蓋人工記錄的數(shù)據(jù)和GPS、溫濕度計(jì)、便攜式水質(zhì)分析儀等的自動(dòng)記錄數(shù)據(jù)。照片、視頻應(yīng)為數(shù)字載體的自動(dòng)記錄。保存原始記錄需長(zhǎng)期保存以備查閱。電子記錄需備份保存。調(diào)查結(jié)果調(diào)查結(jié)果需提交相關(guān)表格、文字、圖片和影像材料等。中國(guó)大鯢野外種群及棲息地調(diào)查的報(bào)告應(yīng)對(duì)調(diào)查方法、種群數(shù)量（密度）、分布、棲息地狀況、受威脅因素等進(jìn)行詳細(xì)敘述。同時(shí)還需要對(duì)調(diào)查到的每一尾中國(guó)大鯢的形態(tài)學(xué)性狀和遺傳背景分別進(jìn)行測(cè)量和分析。

（資料性附錄）

大鯢野外種群調(diào)查記錄表大鯢野外種群調(diào)查記錄參見(jiàn)表A.1。大鯢野外種群調(diào)查記錄表樣線：地點(diǎn)：調(diào)查日期：年月日開(kāi)始時(shí)間：時(shí)分結(jié)束時(shí)間：時(shí)分起點(diǎn)經(jīng)緯度：海拔：終點(diǎn)經(jīng)緯度：海拔：觀測(cè)者：記錄者：樣線長(zhǎng)：樣線寬：天氣：編號(hào)中文名調(diào)查方法個(gè)體數(shù)量備注成體亞成體幼體卵

（資料性附錄）

中國(guó)大鯢主要形態(tài)學(xué)性狀記錄表中國(guó)大鯢主要形態(tài)學(xué)性狀記錄參見(jiàn)表B.1。中國(guó)大鯢主要形態(tài)學(xué)性狀記錄表日期時(shí)間記錄人樣線樣點(diǎn)編號(hào)經(jīng)度緯度海拔幼體/亞成體/成體性別健康狀況是否存在外部傷口是否存在細(xì)菌或病毒感染是否有寄生蟲(chóng)全長(zhǎng)（cm）體重（g）頭長(zhǎng)（mm）眼間距（mm）頭寬（mm）鼻間距（mm）尾長(zhǎng)（mm）后肢全長(zhǎng)（mm）尾寬（mm）前壁及手長(zhǎng)（mm）尾高（mm）眼徑（mm）

（資料性附錄）

e-DNA監(jiān)測(cè)記錄表e-DNA監(jiān)測(cè)記錄參見(jiàn)表C.1。e-DNA監(jiān)測(cè)記錄表監(jiān)測(cè)樣地：樣方編號(hào)：觀測(cè)者：海拔：經(jīng)度：緯度：風(fēng)力：平靜/微風(fēng)/中/強(qiáng)天氣：氣溫：濕度：日期：起始時(shí)間：結(jié)束時(shí)間：序號(hào)位點(diǎn)號(hào)是否監(jiān)測(cè)到大鯢水樣采集時(shí)間采集編號(hào)生境DNA提取結(jié)果PCR分析檢測(cè)結(jié)果結(jié)論注：DNA提取結(jié)果和PCR檢測(cè)結(jié)果都以陰性和陽(yáng)性表示

（資料性附錄）

中國(guó)大鯢野外棲息地調(diào)查記錄表中國(guó)大鯢野外棲息地調(diào)查記錄表D.1。中國(guó)大鯢野外棲息地調(diào)查記錄表日期時(shí)間記錄人樣線樣點(diǎn)經(jīng)緯度河岸土地利用類型海拔（m）水溫℃氣溫℃溶解氧砂石采挖pH涉水工程建設(shè)電導(dǎo)率農(nóng)牧漁業(yè)活動(dòng)濁度道路建設(shè)總硬度（mg/L）污染類型總氮（mg/L）污染強(qiáng)度總磷（mg/L）餌料豐富度氨氮（mg/L）外來(lái)物種總堿度（mg/L）外來(lái)物種干擾強(qiáng)度水流速度（m/s）河床類型水深cm（離岸0.5m）底質(zhì)河寬（m）植被類型濕度%填表說(shuō)明：河床類型參考GB50707進(jìn)行分類。底質(zhì)分類參照HJ710.8的規(guī)定。森林類型參照HJ1167進(jìn)行劃分。河岸土地利用類型（①河岸兩側(cè)無(wú)耕作土壤，營(yíng)養(yǎng)豐富；②河岸一側(cè)無(wú)耕作土壤，另一側(cè)為耕作土壤；③河岸兩側(cè)耕作土壤；④河岸兩側(cè)為耕作廢棄的裸露的風(fēng)化土壤層，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很少）。污染類型（農(nóng)藥和化肥、生活污水、泥沙懸浮物）。砂石采挖、涉水工程建設(shè)、農(nóng)牧漁業(yè)活動(dòng)、道路建設(shè)、污染強(qiáng)度等干擾分類（①?gòu)?qiáng)：生境受到嚴(yán)重干擾；植被基本消失；野生動(dòng)物難以棲息繁衍；②中：生境受到干擾；植被部分消失，但干擾消失后，植被仍可恢復(fù)；野生動(dòng)物棲息繁衍受到一定影響，但仍然可以棲息繁衍；③弱：生境受到一定干擾；植被基本保持原樣；對(duì)野生動(dòng)物棲息繁衍影響不大；④無(wú)：生境沒(méi)有受到干擾；植被保持原始模樣；對(duì)野生動(dòng)物棲