第第頁丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）試劑盒說明書丙酮酸激酶（Pyruvatekinase，PK）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：PK（EC2.7.1.40）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化糖酵解過程中的最后一步反應(yīng)，是糖酵解過程中的主要限速酶之一，也是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶之一，因此測定PK活性具有重要意義。測定原理：PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脫氫酶進一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PK活性。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水試劑的組成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保存;試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；；試劑二：粉劑×2瓶，20℃保存；試劑三：液體10μL×2支，4℃保存；樣本的前處理：1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。3、血清（漿）樣品：直接檢測。測定步驟：1、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測定（1）試劑二的配制：臨用前取試劑二一瓶，加入9mL試劑一和1.06mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。（2）試劑三的配制：臨用前取試劑三一支，加入0.6mL蒸餾水充分溶解待用；現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三和180μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1A2.PK活性計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下1、血清（漿）中PK活力的計算:單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=1608×ΔA2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W（3）按細菌或細胞密度計算：單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.216×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。b.用96孔板測定的計算公式如下1、血清（漿）中PK活力的計算:單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3216×ΔA2、組織、細菌或細胞中PK活力的計算:（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W（3）按細菌或細胞密度計算：單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。PK（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.432×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/m