鎖陽(yáng)不同溶劑提取物的提取研究

鎖陽(yáng)是封閉科的肉桂枝，也被稱為鎖陽(yáng)科。它具有兩種食物用途。廣泛分布于我國(guó)西北沙漠、戈壁和沙漠地區(qū)。研究表明:鎖陽(yáng)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗缺氧和抗氧化等生理活性。鎖陽(yáng)抗氧化活性的研究表明:鎖陽(yáng)粗多糖具有清除自由基的作用,鎖陽(yáng)提取物可提高抗氧化酶活性,清除羥基自由基和超氧陰離子作用。本文系統(tǒng)地研究鎖陽(yáng)不同溶劑提取物清除自由基活性,通過(guò)綜合評(píng)價(jià)篩選出清除自由基活性的最佳提取物,并通過(guò)測(cè)定鎖陽(yáng)不同溶劑提取物中總黃酮含量,探索鎖陽(yáng)清除自由基活性的物質(zhì)基礎(chǔ),為合理開(kāi)發(fā)和有效利用鎖陽(yáng)資源提供了依據(jù)。經(jīng)文獻(xiàn)檢索,未見(jiàn)相同研究報(bào)道。1材料和方法1.1鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)莖鎖陽(yáng)樣品購(gòu)自甘肅省人民醫(yī)院藥劑科,樣品由中科院蘭州化物所戚歡陽(yáng)副研究員鑒定為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)(CynomoriumsongaricumRupr.)的肉質(zhì)莖。1.2儀器、藥品和試劑SHA-B多功能恒溫振蕩器:江蘇正基儀器有限公司;BT224S分析天平:Sartorius;CH-8606微量分析天平:Mettler-Toledo;DZF-6050真空干燥箱:鞏義市英峪予華儀器廠;RE-52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:鞏義市予華儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外-紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限公司。1,1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司,批號(hào)為S43654-098;兒茶素、蘆丁對(duì)照品:中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所,批號(hào)分別為100080-200306、877-200001;雙重蒸餾水:實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑:分析純。1.3各種溶劑提取自鎖陽(yáng)，dpph活性測(cè)定1.3.1鎖陽(yáng)溶劑提取液的制備將陰干的鎖陽(yáng)肉質(zhì)莖粉碎后過(guò)26目篩,精密稱取一定量的鎖陽(yáng)粉末,按1g∶20mL加入不同提取溶劑(水、pH3水、60%乙醇、95%乙醇、水飽和正丁醇、正丁醇、乙酸乙酯),在恒溫振蕩器上室溫振搖6h,過(guò)濾,得鎖陽(yáng)不同溶劑提取液。分別在40℃(95%乙醇、乙酸乙酯提取液)和75℃(水、pH3水、60%乙醇、正丁醇和水飽和正丁醇提取液)下,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮至近干時(shí),用少量溶劑轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中,經(jīng)真空干燥(50℃、-0.08MPa)得鎖陽(yáng)不同溶劑提取物,低溫保存?zhèn)溆谩?.3.2提取溶劑的確定精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品DPPH·約12mg,用甲醇定容至250mL,即得DPPH·標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(119.7μmol/L),低溫保存。臨用時(shí)將儲(chǔ)備液稀釋至59.85μmol/L的工作溶液。精密稱取約25.0mg鎖陽(yáng)不同溶劑提取物,用相應(yīng)的提取溶劑定容至25mL。精密吸取適量,用相應(yīng)的提取溶劑稀釋至濃度為0.2mg/mL的樣品溶液。1.3.3確定最大吸收波長(zhǎng)取1.3.2項(xiàng)制備的工作溶液,以甲醇做參比溶液,在分光光度計(jì)上400~900nm范圍內(nèi)掃描,確定最大吸收波長(zhǎng)。分別精密吸取1.3.2項(xiàng)制備的樣品溶液0.1mL,加入到3.9mLDPPH·工作溶液中,反應(yīng)總體積為4.0mL,迅速振搖,在選定的最大吸收波長(zhǎng)處,測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化趨勢(shì),每60s取值一次,確定吸光度達(dá)到穩(wěn)定水平所需時(shí)間。1.3.4dpph清除率分別取1.3.2項(xiàng)制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液,按照1.3.3項(xiàng)優(yōu)化的條件測(cè)定,按公式(1)計(jì)算鎖陽(yáng)不同溶劑提取物樣品溶液的自由基清除率。DPPH·清除率(%)=((AC-AS)/AC)×100(1)式中:AC為3.9mLDPPH·工作溶液與0.1mL甲醇混合后的吸光度;AS為3.9mLDPPH·溶液與0.1mL樣品溶液反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定水平時(shí)的吸光度。1.3.5清除自由基活性的測(cè)定分別精密稱取蘆丁對(duì)照品、兒茶素對(duì)照品適量,用甲醇配制濃度為0.52、0.66mg/mL對(duì)照品溶液。精密稱取提取物適量,用相應(yīng)溶劑配制濃度為1.0mg/mL樣品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、樣品溶液適量,依次用相應(yīng)溶劑稀釋成所需的各種濃度。分別精密吸取0.1mL不同濃度的上述溶液,加入到3.9mLDPPH·工作溶液中,在適宜的反應(yīng)時(shí)間后測(cè)定吸光度,并按式(1)計(jì)算自由基清除率。以濃度與自由基清除率作圖,求得清除50%DPPH·所需樣品的濃度,即半抑制濃度IC50,比較鎖陽(yáng)提取物與兒茶素和蘆丁清除DPPH·活性。1.4黃酮含量是通過(guò)鎖陽(yáng)不同溶劑提取的參照文獻(xiàn)測(cè)定鎖陽(yáng)不同提取物中總黃酮含量。2結(jié)果與分析2.1索陽(yáng)各種溶劑提取物提取物的提取率由表1可知,鎖陽(yáng)經(jīng)不同溶劑提取的浸膏得率中,鎖陽(yáng)60%乙醇提取的浸膏得率最高,為50.23%。2.2dpph活性由不同的鎖陽(yáng)溶劑提取物決定2.2.1反應(yīng)時(shí)間的確定經(jīng)過(guò)波長(zhǎng)掃描,選擇517nm進(jìn)行檢測(cè)。分別在DPPH·甲醇溶液中加入0.2mg/mL的鎖陽(yáng)不同溶劑提取物樣品溶液后,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)而減小,但在10min內(nèi)均達(dá)到穩(wěn)定水平,故本方法確定反應(yīng)時(shí)間為10min。其中,95%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物到達(dá)反應(yīng)完全所需時(shí)間較短。2.2.2清除dpph活性由表1可以看出,按照1.3.4項(xiàng)測(cè)定鎖陽(yáng)不同溶劑提取物清除DPPH·活性,由強(qiáng)到弱依次為:水飽和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。2.3最佳提取物篩選及dpph活性分析2.3.1乙醇提取物清除率及浸膏得率由表1可以看出,雖然水飽和正丁醇提取物清除率(38.70%)較60%乙醇提取物清除率略高(36.47%),但60%乙醇提取物浸膏得率(50.23%)遠(yuǎn)高于水飽和正丁醇提取物浸膏得率(8.83%)。經(jīng)綜合評(píng)價(jià),60%乙醇提取物為鎖陽(yáng)清除自由基活性最佳提取物。2.3.2反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定水平的情況由圖2可知,當(dāng)60%乙醇提取物的濃度≤0.2mg/mL時(shí),反應(yīng)10min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定水平;而濃度增加到0.3mg/mL時(shí),反應(yīng)至15min才達(dá)到穩(wěn)定水平時(shí)。60%乙醇提取濃度越大,吸光度到達(dá)穩(wěn)定水平時(shí),所需時(shí)間越長(zhǎng)。2.3.3半抑制濃度試驗(yàn)由圖3可知,按照1.3.5項(xiàng)得到60%乙醇提取物、蘆丁、兒茶素對(duì)照品清除50%DPPH·的濃度,即半抑制濃度IC50分別為4.60、2.53、1.19mg/L。3帶陽(yáng)中dpph活性物質(zhì)激活因素的研究天然產(chǎn)物中黃酮類化合物具有較強(qiáng)的清除自由基活性,為了闡明鎖陽(yáng)清除自由基活性的物質(zhì)基礎(chǔ),分別測(cè)定鎖陽(yáng)不同溶劑提取物中總黃酮含量。3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程3.2其它有機(jī)溶劑提取物清除dpph活性的影響成分如表1所示,鎖陽(yáng)不同溶劑提取物清除DPPH·活性由強(qiáng)到弱依次為:水飽和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。相應(yīng)的總黃酮含量由高到低依次為:水飽和正丁醇提取物>60%乙醇提取物>正丁醇提取物>95%乙醇提取物>水提取物>pH3水提取物>乙酸乙酯提取物。除水提取物外,其他提取物清除DPPH·活性與相應(yīng)的黃酮含量成正相關(guān)。水提取物清除DPPH·活性與其總黃酮含量的不對(duì)稱,可能是由于水提物中的清除DPPH·活性物質(zhì)除總黃酮外,還有活性多糖協(xié)同作用的結(jié)果。黃酮不易溶于酸性水,pH3水提取物總黃酮含量較低,清除自由基活性較水提取物差。水飽和正丁醇提取物、60%乙醇提取物當(dāng)中的總黃酮含量較多,其清除DPPH·活性較強(qiáng)。乙酸乙酯為親脂性溶劑,鎖陽(yáng)乙酸乙酯提取物中未檢測(cè)到總黃酮,其清除DPPH·活性最弱。綜上可知,鎖陽(yáng)清除DPPH·活性的物質(zhì)基礎(chǔ)與總黃酮具有密切關(guān)系。4不同有機(jī)溶劑提取的總黃酮含量對(duì)清除dpph活性的影響本文利用DPPH·法分別考察鎖陽(yáng)不同溶劑提取物清除DPPH·活性,并以提取物浸膏得率和DPPH·清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選出最佳提取物為60%乙醇提取物。通過(guò)測(cè)定鎖陽(yáng)不