3種益生素配伍對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)、消化及腸道菌群組成的影響

食物中的藥物添加劑容易破壞水生動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡，降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于頻繁使用，可能會(huì)出現(xiàn)抗?jié)B透性、殘留和水污染等問(wèn)題（丁燕文等，2000；elisantal，2002；eleonontal，2002）。研制和開(kāi)發(fā)無(wú)毒、無(wú)副作用、天然的免疫生長(zhǎng)促進(jìn)劑是水產(chǎn)營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。益生素是有利于動(dòng)物生長(zhǎng)和健康的化學(xué)與生物類(lèi)添加劑總稱(chēng),包括活菌制劑、酶制劑、寡糖、多糖等。目前,單一益生素在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中應(yīng)用研究報(bào)道較多,Kozasa(1986)報(bào)道益生菌可以提高動(dòng)物飼料利用率,劉波等(2005)用地衣芽孢桿菌添加于飼料中飼喂異育銀鯽后發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌能提高魚(yú)類(lèi)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率,從而促進(jìn)生長(zhǎng)。華雪銘等(2001)在飼料中添加芽孢桿菌和硒酵母可提高異育銀鯽的生長(zhǎng)及抗病力。張宏福等(2001)研究表明,異麥芽低聚糖會(huì)改變?cè)缙跀嗄套胸i腸道菌群。陳代文等(2005)添加益生素和寡糖于斷奶仔豬日糧中能顯著提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率,且益生素和寡糖對(duì)能量、有機(jī)物質(zhì)、干物質(zhì)消化率存在顯著的互作效應(yīng)。徐勇等(2002)發(fā)現(xiàn)低聚木糖對(duì)青春雙歧桿菌的增殖作用。而芽孢桿菌、寡糖、酶制劑等配伍物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖的協(xié)同作用至今報(bào)道很少。本研究中作者應(yīng)用芽孢桿菌、寡糖、酶制劑等3種益生素及相互配伍添加到異育銀鯽飼料中,探討它們對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、免疫、腸道內(nèi)菌群和內(nèi)源酶活性及其表達(dá)量的影響和協(xié)同作用,為益生素在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中科學(xué)應(yīng)用和開(kāi)發(fā)環(huán)保型飼料提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1芽孢桿菌制劑試驗(yàn)魚(yú)選用異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)1齡魚(yú)種,體重為(30±2)g,購(gòu)于南京市水產(chǎn)良種場(chǎng)。地衣芽孢桿菌制劑,每克產(chǎn)品含2×1010個(gè)芽孢菌數(shù),由美國(guó)雅來(lái)大藥廠提供。低聚木糖產(chǎn)品,由江蘇康維生物有限公司提供,含量為35%。復(fù)合酶制劑(八寶威),含有蛋白酶、淀粉酶等八種以上微生物酶,由美國(guó)建明工業(yè)公司提供。1.2飼料配方與飼養(yǎng)過(guò)程隨機(jī)將196尾異育銀鯽魚(yú)種分成4組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),共用12個(gè)水族箱(規(guī)格為0.85m×0.45m×0.55m),每箱16尾魚(yú)。其中,1組投喂的為基礎(chǔ)飼料,2、3、4組投喂的飼料是在基礎(chǔ)飼料中分別添加100μg/g地衣芽孢桿菌、100μg/g地衣芽孢桿菌與100μg/g低聚木糖、100μg/g地衣芽孢桿菌與300μg/g復(fù)合酶制劑。各組飼料逐級(jí)混和均勻,再加水拌勻,用小型絞肉機(jī)制成顆粒,自然晾干后放入-20℃冰箱中儲(chǔ)藏備用?；A(chǔ)飼料配方見(jiàn)表1。異育銀鯽馴化養(yǎng)殖10天后投喂添加試驗(yàn)飼料,每天投餌率3%左右,分別在8∶30、13∶30與18∶30各投喂一次,1h后觀察吃食情況,并將多余飼料吸出,估算余餌量。飼養(yǎng)過(guò)程采用流水養(yǎng)殖系統(tǒng),水溫為(25±2)℃,溶氧4mg/L以上,早晚各吸污一次。共飼養(yǎng)112天,其中前期馴化10天,正式試驗(yàn)102天。1.3干物質(zhì)及粗蛋白養(yǎng)殖試驗(yàn)30天后,用含1%Cr2O3指示劑試驗(yàn)飼料投喂魚(yú)類(lèi),每天喂料2h后收集糞便,收集時(shí)用撈網(wǎng)撈起條狀糞便,用鑷子選擇新鮮、外表帶有包膜、盡可能完整糞便放在干凈培養(yǎng)皿中,在60℃的烘箱中烘干,保存在-26℃條件下待測(cè)干物質(zhì)、粗蛋白表觀消化率。其中干物質(zhì)測(cè)定用烘箱烘干(105℃)法,蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法,Cr2O3含量采用濕式灰化定量法。魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖112天,試驗(yàn)結(jié)束后取樣并稱(chēng)重,每組取6尾異育銀鯽,于冰盤(pán)上解剖,取出腸道和肝胰臟,剔除脂肪組織,用4℃冷卻去離子水沖洗,然后用濾紙輕輕吸干水分,放入-26℃冰箱中冷卻保存,供測(cè)酶活性之用。酶活性測(cè)定參照劉波等(2005)。1.4多次進(jìn)行第1—腸道菌群培養(yǎng)與計(jì)數(shù)試驗(yàn)結(jié)束時(shí),每組取4尾魚(yú)采樣。取腸中食糜0.2g于無(wú)菌離心管中,加入無(wú)菌0.85%生理鹽水1.8ml,制成原液,然后依次進(jìn)行101—106倍稀釋。取100μl稀釋液以平板涂布法接種于培養(yǎng)基上,大腸桿菌采用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌采用乳酸桿菌專(zhuān)用培養(yǎng)基、芽孢桿菌采用芽孢桿菌專(zhuān)用培養(yǎng)基等,大腸桿菌與芽孢桿菌37℃有氧培養(yǎng),乳酸桿菌37℃有氧培養(yǎng)48h后,選擇平均菌落數(shù)為30—300的稀釋度用于菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算方法采用每克食糜菌落形成單位即CFU/g(平均菌落×稀釋倍數(shù)×10)。1.5數(shù)據(jù)處理rna試驗(yàn)結(jié)束后,每組取4尾魚(yú)采樣,取異育銀鯽敲擊腦部,致使魚(yú)類(lèi)昏迷,快速解剖提取肝胰臟中胰管周?chē)慕M織200mg左右,加入1mlTrizolRegent,快速勻漿,15—30℃靜置5min,加入0.2mlTrizolRegent顛倒15s,15—30℃靜置3min,4℃離心15min(1500r/min),取上清液0.5ml加入0.5ml異丙醇混勻,15—30℃靜置10min,4℃離心10min(1500r/min),棄上清液,加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀,4℃離心5min(10000r/min),棄上清液,將沉淀RNA真空干燥5min,以20μlDEPC處理水溶解。將RNA溶液稀釋為0.5μg/ml,立即用于后續(xù)測(cè)定。測(cè)定方法參照王梁燕等(2004)。1.6統(tǒng)計(jì)分析軟件s實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel作初步處理,SPSS(Ver.11.5)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)各組之間的差異采用單因子方差(One-WayANOVA)分析,多重比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2結(jié)果與分析2.1對(duì)芽孢桿菌添加量的影響由表2可知,試驗(yàn)組魚(yú)類(lèi)的增重率比對(duì)照組均有提高,其中以芽孢桿菌和寡糖配伍組增重率最高,比對(duì)照組提高了43.78%(P<0.05),其次為芽孢桿菌添加組,增重率比對(duì)照組提高了23.97%(P<0.05);酶制劑與芽孢桿菌配伍添加組增重率也比對(duì)照組提高了18.36%(P<0.05)。餌料系數(shù)變化與增重率相反,各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比,餌料系數(shù)均有下降,且差異顯著(P<0.05),即添加芽孢桿菌等益生素各試驗(yàn)組均可促進(jìn)異育銀鯽的生長(zhǎng),降低餌料系數(shù),提高飼料利用率。2.2最佳配比的確定由表3可知,各試驗(yàn)組的蛋白質(zhì)表觀消化率與對(duì)照組都比對(duì)照組高,且差異顯著(P<0.05)。酶制劑與芽孢桿菌配伍組的蛋白表觀消化率最高,其次為芽孢桿菌組、芽孢桿菌與寡糖配伍組,分別比對(duì)照組高7.36%、7.22%和7.07%。與對(duì)照組的干物質(zhì)表觀消化率相比,試驗(yàn)組干物質(zhì)表觀消化率均提高,且差異顯著(P<0.05),芽孢桿菌與寡糖配伍組最高,其次為芽孢桿菌組,最后為酶制劑與芽孢桿菌配伍組。結(jié)果顯示,各種益生素及配伍組合均能提高異育銀鯽的表觀消化率和干物質(zhì)表觀消化率。各試驗(yàn)組異育銀鯽的食糜蛋白酶活性與對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05),芽孢桿菌組、芽孢桿菌與寡糖配伍組、芽孢桿菌與酶制劑配伍組的食糜蛋白酶活分別比對(duì)照組高了91.44%、104.66%、84.09%,尤其以芽孢桿菌和寡糖配伍組最高,其次為芽孢桿菌組。與對(duì)照組相比,各試驗(yàn)組的腸道蛋白酶活性均有提高,且差異顯著(P<0.05)。但是與食糜蛋白酶活有所不同的是,腸道蛋白酶活最高組是芽孢桿菌與酶制劑配伍組,比對(duì)照組高出35.19%,其次為芽孢桿菌與寡糖配伍組,比對(duì)照組高33.42%,最后為芽孢桿菌組,比對(duì)照組高31.15%。2.3芽孢桿菌和酶制劑配伍對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響由表4可知,在大腸桿菌數(shù)量上面,各實(shí)驗(yàn)組均比對(duì)照組大幅減少且差異顯著(P<0.05)。芽孢桿菌組的腸道中大腸桿菌數(shù)量最少,比對(duì)照組減少了89.68%;其次為芽孢桿菌和寡糖配伍組,比對(duì)照組減少了89.53%;芽孢桿菌和酶制劑配伍組中大腸桿菌也比對(duì)照組減少了58.14%。芽孢桿菌方面,除酶制劑組外,各種添加劑對(duì)芽孢桿菌均有促生長(zhǎng)作用且差異顯著(P<0.05)。芽孢桿菌與寡糖配伍組對(duì)芽孢桿菌的促生長(zhǎng)作用有其明顯,芽孢桿菌的數(shù)量是對(duì)照組的1.73倍;芽孢桿菌組的數(shù)量是對(duì)照組的1.63倍;相反,酶制劑與芽孢桿菌配伍組抑制了芽孢桿菌的生長(zhǎng),數(shù)量比對(duì)照減少了60.32%。在各試驗(yàn)組乳酸桿菌的數(shù)量減少了,且差異顯著(P<0.05)。酶制劑與芽孢桿菌組的乳酸桿菌數(shù)量最少,比對(duì)照組減少了67.62%,其次為芽孢桿菌組,減少了57.21%,最后為芽孢桿菌與寡糖配伍組,比對(duì)照組減少了54.61%。2.4桿菌和寡糖配伍試驗(yàn)由表5可知,試驗(yàn)各組的異育銀鯽肝胰臟中胰蛋白酶mRNA表達(dá)水平以芽孢桿菌和寡糖配伍試驗(yàn)組最高(P<0.05),比對(duì)照組提高254.10%,其次為芽孢桿菌試驗(yàn)組(P<0.05),比對(duì)照組提高81.21%。酶制劑與芽孢桿菌配伍組的異育銀鯽胰蛋白酶mRNA表達(dá)水平反而低于對(duì)照組。3討論3.1芽孢桿菌與寡糖配伍對(duì)食糜酶活性的影響無(wú)論是芽孢桿菌,芽孢桿菌和寡糖配伍組,還是芽孢桿菌和酶制劑配伍,都能夠促進(jìn)異育銀鯽的生長(zhǎng),提高增重,降低餌料系數(shù),此結(jié)果與已報(bào)道的研究成果類(lèi)似(肖明松等,2005)。芽孢桿菌、寡糖、酶制劑及它們的配伍物可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng),提高增重率,降低餌料系數(shù),其可能的原因是多方面的,包括營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的提高、消化道酶活力的增加及酶mRNA表達(dá)量的增加、腸道內(nèi)有害微生物的減少、免疫力的增強(qiáng)等。現(xiàn)有研究表明,芽孢桿菌能產(chǎn)生多種酶類(lèi),如:蛋白酶、淀粉酶和果膠酶等,而且許多酶是動(dòng)物體本身不具有的酶,在飼料中添加芽孢桿菌,可提高異育銀鯽腸道、肝胰臟的蛋白酶活和淀粉酶活性(劉小剛等,2002;劉波等,2005)。芽孢桿菌在動(dòng)物體內(nèi)還能產(chǎn)生有效的酶促活性因子,這些活性因子提高了宿主的消化酶活性(Koushiketal,2002)。寡糖對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)酶活影響的報(bào)道不多,肖明松等(2005)報(bào)道果寡糖能夠明顯增強(qiáng)鯉魚(yú)腸道蛋白酶活力和肝胰臟蛋白酶活力。寡糖促進(jìn)酶活增加的可能是促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌等的增殖,可產(chǎn)生蛋白等物質(zhì)分解酶,從而提高內(nèi)容物中消化酶的活性。加上芽孢桿菌分泌的酶,故在食糜酶活性方面,本試驗(yàn)結(jié)果中寡糖與芽孢桿菌配伍組的酶活是最高。酶制劑主要原理除了直接補(bǔ)充內(nèi)源酶不足外,還可以增加魚(yú)類(lèi)本身不產(chǎn)生的一些酶,提高酶活性和消化吸收率。本試驗(yàn)結(jié)果中,食糜的蛋白酶活性是芽孢桿菌和寡糖配伍組最高,而芽孢桿菌與酶制劑組合組最低,可見(jiàn)芽孢桿菌與寡糖配伍可以顯著增加益生菌的數(shù)量引起益生菌分泌的胞外酶彌散到食糜中,食糜蛋白酶增多,酶活性顯著提高;而腸道組織蛋白酶活性是酶制劑與芽孢桿菌配伍組最高而芽孢桿菌組最低,說(shuō)明酶制劑可以促進(jìn)異育銀鯽本身加快分泌內(nèi)源蛋白酶,而內(nèi)源蛋白酶的分泌點(diǎn)在腸道上皮細(xì)胞上,測(cè)定時(shí)有可能上皮細(xì)胞并未脫落,因此,腸道中的蛋白酶活性反而是酶制劑組最高。由此可見(jiàn)酶制劑的作用是可以提高動(dòng)物內(nèi)源蛋白酶分泌,從而促進(jìn)消化率,促使動(dòng)物生長(zhǎng)。3.2寡糖對(duì)腸道菌群的影響腸道微生物是動(dòng)物完整消化系統(tǒng)的組成部分,消化系統(tǒng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收能力部分地依賴(lài)于腸道中微生物分布的種類(lèi)和數(shù)量。腸道中微生物的種類(lèi)決定了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程的范圍、微生物的數(shù)量決定了代謝的程度。有研究表明,飼用芽孢菌能使有益菌群增殖,產(chǎn)生蛋白類(lèi)拮抗物質(zhì),同時(shí)芽孢桿菌可以和有害微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),拮抗腸道病原細(xì)菌,維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡作用(胡東興,19961)),劉波等(2005)用地衣芽孢桿菌作為添加劑飼喂異育銀鯽后發(fā)現(xiàn)魚(yú)體腸道內(nèi)芽孢桿菌、乳酸桿菌數(shù)量均有提高,而大腸桿菌數(shù)量減少。寡糖是否能夠促進(jìn)腸道菌群改變還有爭(zhēng)議,雖然寡聚糖不能被消化道內(nèi)的消化酶消化,但大多數(shù)腸道有益菌如雙歧桿菌、乳酸桿菌能產(chǎn)生一系列糖苷酶而將低聚糖作為其碳源,而梭狀芽孢桿菌、真桿菌、腸桿菌或大腸桿菌等有害菌對(duì)其不能利用或代謝利用率很低,楊桂蘋(píng)(1999)認(rèn)為,這是因?yàn)楦鞣N細(xì)菌內(nèi)消化低聚糖的酶的活性不同造成的,雙歧桿菌中這些酶的活性顯著高于其他腸道菌,而大腸桿菌等一些致病菌中不存在消化低聚糖的酶。本研究結(jié)果表明,寡糖可以顯著地抑制致病性大腸桿菌地生長(zhǎng)和有益菌芽孢桿菌的增殖。其可能的原因是寡糖能作為益生菌的增殖因子,從而促進(jìn)有益微生物大量增殖,調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡。而低聚木糖類(lèi)物質(zhì)能通過(guò)對(duì)腸道粘膜上皮的競(jìng)爭(zhēng)性,能與病原菌的外源凝集素特異性結(jié)合,使病原菌不能在腸壁上粘附,而隨低聚木糖排除體外,或產(chǎn)生抗菌物質(zhì)阻止大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等致病菌的粘附、定植,增強(qiáng)有益菌競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),阻斷其致病性產(chǎn)生。酶制劑也可以改善腸道菌群狀態(tài)。研究已發(fā)現(xiàn)外源酶在改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收的同時(shí)也導(dǎo)致腸道微生物的變化(張宏福等,2001)。腸道微生物的變化僅僅是微生物對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)或這種變化對(duì)于使用外源酶制劑后動(dòng)物的生理應(yīng)答發(fā)揮重要作用。水產(chǎn)動(dòng)物消化系統(tǒng)不分泌非淀粉多糖酶,飼料中的可溶性NSP在前腸不被消化。這些未被消化的可溶性NSP進(jìn)入后腸,為有害厭氧微生物增殖發(fā)酵提供碳源。而酶制劑降解NSP后,產(chǎn)生的某些寡聚糖可防止有害菌在后腸道定植,減輕病原菌對(duì)機(jī)體的毒害,并且可促進(jìn)部分有益微生物的增殖。事實(shí)上不同試驗(yàn)間動(dòng)物微生物的數(shù)量差異極大,可能也是導(dǎo)致試驗(yàn)間不同結(jié)果的原因。本試驗(yàn)中酶制劑與芽孢桿菌的配伍組合促使不僅大腸桿菌數(shù)量的下降,其他菌數(shù)量也急劇下降,便有可能是以上原因造成。3.3消化酶基因表達(dá)基因的表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜而精確的多級(jí)調(diào)控過(guò)程。在細(xì)胞外,涉及到由激素和受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過(guò)程,在細(xì)胞內(nèi)涉及到轉(zhuǎn)錄前染色質(zhì)的活化、轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后的加工、翻譯水平的調(diào)節(jié)及翻譯后的修飾等。在這些調(diào)控步驟中,基因的轉(zhuǎn)錄是遺傳信息傳遞過(guò)程中最具有選擇性的步驟,也是基因表達(dá)調(diào)控的中心環(huán)節(jié),基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。因此,對(duì)于魚(yú)類(lèi)消化酶基因表達(dá)的研究,多集中于探討不同條件下消化酶基因mRNA表達(dá)水平的變化,以及m