胃蛋白酶與胰蛋白酶反應(yīng)條件的研究

與外包酶和胰酶的外部消化試驗(yàn)相比，本試驗(yàn)在模擬動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境時(shí)提出了一種新方法，對(duì)實(shí)踐中具有一定的意義。1材料和主要設(shè)備1.1材料表面仔雞飼料、仔豬飼料、菜粕、棉粕、豆粕、血球粉。1.2胃蛋白酶緩沖溶液的配制0.2%胃蛋白酶溶液:將2~3mL濃鹽酸稀釋至1,000mL水中(調(diào)節(jié)溶液pH=1~2),加熱至42~45℃,加入2g活性為1∶10,000生化級(jí)胃蛋白酶(若活性不是1∶10,000,可使用活性1∶3,000生化級(jí)胃蛋白酶,應(yīng)注意胃蛋白酶溶液中胃蛋白酶濃度應(yīng)為mL/20IU),并緩慢攪拌直至溶解,臨用前配制;pH7.6磷酸鹽緩沖液:0.2mol/LNa2HPO4與0.2mol/LNaH2PO4按體積87∶13配置成pH7.6磷酸鹽緩沖液;0.1%胰蛋白酶溶液,將1g胰酶與1g無(wú)水氯化鈣混合,加入少量磷酸鹽緩沖液溶解后繼續(xù)稀釋到1,000mL,用0.1mol/LNaOH調(diào)pH至7.8,使用前預(yù)溫到37℃;0.6mol/LNaOH;5%三氯乙酸。1.3設(shè)備恒溫平轉(zhuǎn)搖床、粉碎機(jī)、20目篩網(wǎng)、索氏抽提器、定氮儀器。2方法和結(jié)果2.1條件測(cè)試2.1.1ph對(duì)粗蛋白消化率的影響動(dòng)物體內(nèi)胃液的pH一般在0.9~1.8之間,根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物蛋白質(zhì)飼料消化率的測(cè)定》其胃蛋白酶溶液的pH在1.0~2.0之間,濃度為0.2%。以菜粕為底物,按規(guī)定濃度,配置pH不同的6組胃蛋白溶液,pH分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0,每個(gè)樣設(shè)2組重復(fù),消化結(jié)束后,取未消化部分測(cè)定粗蛋白,根據(jù)結(jié)果選擇最佳pH值。結(jié)果見(jiàn)表一。由表1可知,pH在1.2、1.6、1.8、2.0消化率都達(dá)到85%以上,在1.0時(shí)消化率最低,在1.8時(shí),蛋白消化率有個(gè)最高峰。因此可以確定最佳pH值為1.8。2.1.2胃蛋白酶添加量的確定以菜粕為底物,根據(jù)最適pH,分別做5組實(shí)驗(yàn),其胃蛋白酶液添加量分別為20、25、30、35、40mL,每組設(shè)2個(gè)重復(fù),消化結(jié)束后,取未消化部分測(cè)定粗蛋白,根據(jù)結(jié)果選擇最佳胃蛋白酶添加量。結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,當(dāng)0.2%胃蛋白酶添加體積30mL以上時(shí),消化率都超過(guò)85%,添加量為30mL時(shí),到達(dá)最大,為85.416%。2.1.3反應(yīng)ph對(duì)粗蛋白的影響根據(jù)動(dòng)物體內(nèi)胰液的pH在7.8~8.4之間,以菜粕為底物,配置成pH不同的7組溶液,pH分別為7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4,每組設(shè)2個(gè)重復(fù),消化結(jié)束后,取未消化部分測(cè)定粗蛋白,根據(jù)結(jié)果選擇最佳反應(yīng)pH值。結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,pH在7.8時(shí),蛋白消化率最高,隨著pH增大,消化率逐漸降低。2.1.40.1%胰蛋白酶添加量的選擇2.2粗蛋白的測(cè)定確定最佳反應(yīng)條件為底物2g,反應(yīng)溫度37℃,0.2%胃蛋白酶溶液pH1.8,添加量30mL,0.1%胰蛋白酶溶液pH7.8,添加量35mL。具體方案如下。2.2.1采集樣品,粉碎后過(guò)20目篩。2.2.2取2g飼料樣品,加入0.2%胃蛋白酶鹽酸溶液30mL,于pH=1.8和37℃條件下孵育1h(各組均設(shè)2個(gè)重復(fù),結(jié)果取平均值)。2.2.3培養(yǎng)結(jié)束后立即用0.6mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.8。2.2.4隨后加入溶有0.1%胰酶的pH7.8的磷酸緩沖液35mL,繼續(xù)在37℃條件下培養(yǎng)6h。2.2.5最后加入5mL5%的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)。2.2.6培養(yǎng)底物用Whatman3#濾紙過(guò)濾,濾渣用凱氏定氮法測(cè)定含氮量并計(jì)算出粗蛋白含量。2.2.7粗蛋白消化率=(總蛋白-殘?jiān)鞍?/總蛋白×100%2.3粗蛋白消化率測(cè)定飼料摸擬體內(nèi)蛋白消化率測(cè)試,樣品分別為仔雞飼料、仔豬飼料、菜粕、棉粕、豆粕、血球粉共計(jì)6組,每組設(shè)2個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)2g飼料樣品,在最佳反應(yīng)條件下,測(cè)定其反應(yīng)后粗蛋白消化率,結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,仔豬飼料、仔雞飼料、菜粕、豆粕消化率存在差異,血球粉有較高的消化率。3不同酶液添加量對(duì)消化率的影響以菜粕為底物,根據(jù)最適pH,分別作5組實(shí)驗(yàn),其胰蛋白酶液添加量分別為20、25、30、35、40mL,每組設(shè)2個(gè)重復(fù),消化結(jié)束后,取未消化部分測(cè)定粗蛋白,根據(jù)結(jié)果選擇最佳胰蛋白酶添加量。結(jié)果見(jiàn)表4,由表4可知,酶液添加量在35mL時(shí),蛋白消化率最高。3.1本試驗(yàn)通過(guò)模擬動(dòng)物體內(nèi)消化系統(tǒng),在動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境范圍內(nèi),通過(guò)單因素試驗(yàn),得出胃蛋白酶和胰蛋白酶最佳反應(yīng)條件,分別為濃度0.2%,添加量30mL(底物2g),pH1.8,以及濃度0.1%,添加量35mL(底物2g),pH7