人工蟲(chóng)草多糖對(duì)2型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響

麥冬草是麥角菌科的一種真菌寄生在蝙蝠和昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)上的個(gè)體和尸體。這是中國(guó)的著名藥物，與人參和鹿相似。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其富含蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸和蟲(chóng)草多糖等生物活性物質(zhì),其中蟲(chóng)草多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、保肝保腎、防治急性腎衰竭、抗肝纖維化、抗炎、抗菌等多種藥理作用,因而它對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥的防治作用逐漸受到廣大學(xué)者的重視。黃志江等運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)人工蟲(chóng)草多糖(polysaccharidesfromculturedmyceliumofCordycepssinensis,PCS)能促進(jìn)胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取水平,并推測(cè)其降血糖作用可能與促進(jìn)外周組織的葡萄糖代謝有關(guān)。雖然已證實(shí)PCS有顯著的降血糖作用,但在胰島素抵抗模型動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。因此,筆者在本研究采用FF/STZ誘導(dǎo)胰島素抵抗2型糖尿病(type2diabetesrelatedinsulinresistance,T2DM-IR)模型,首次觀察到不同劑量的蟲(chóng)草多糖改善T2DM-IR小鼠的作用,進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。1材料表面1.1酰甘油、總膽固醇、游離脂肪酸試劑盒蟲(chóng)草發(fā)酵菌絲體(杭州中美華東制藥有限公司),鏈脲佐菌素(STZ,Sigma公司)、吡格列酮(Sigma公司),小鼠胰島素ELISA試劑盒(USCNLIFESCIENCE&TECHNOLOGY公司),三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)測(cè)定試劑盒(上海名典生物工程有限公司)。怡成超越JPS-Ⅲ手持式快速全血葡萄糖測(cè)試儀(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司)、低溫高速離心機(jī)(Hermle公司,德國(guó))、SPX型智能生化培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司)、AVE-852半自動(dòng)生化分析儀(長(zhǎng)沙愛(ài)威科技實(shí)業(yè)有限公司)。1.2粗品多糖的制備采取水煎醇沉法提取,固體發(fā)酵菌絲體樣品陰干后粉碎過(guò)篩孔內(nèi)徑0.425mm(40目)篩,粗粉用10倍60～80℃的水浸5h,收集提取液,減壓濃縮后按Sevag法去除蛋白,濃縮液以95%乙醇沉淀,經(jīng)無(wú)水乙醇和丙酮脫水,收集白色沉淀干燥得粗品多糖,采用硫酸-苯酚法于波長(zhǎng)625nm測(cè)定含量,得率為18.65%。2小鼠血糖等情況檢測(cè)Balb/c小鼠,體質(zhì)量18～20g,適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境1周。給予高脂飼料喂養(yǎng)3周后,連續(xù)3d腹腔注射小劑量STZ(25mg·kg-1),繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。2周后選擇空腹血糖>7mmol·L-1作為糖尿病模型鼠。將50Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常組10只,其他40只建立糖尿病模型,成功后分為4組:模型組、陽(yáng)性藥物組(灌胃給予吡格列酮20mg·kg-1)及低、高劑量藥物組(灌胃給予蟲(chóng)草多糖200,400mg·kg-1),每組10只。正常組和模型組給予等量的純化水,qd,連續(xù)28d。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血糖,末次給藥前禁食12h,灌胃給予葡萄糖2.5g·kg-1,分別測(cè)定小鼠給予葡萄糖后0,0.5,2.0h的血糖值,比較給予葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)血糖曲線下面積變化。血糖曲線下面積(AUC)=0.25×(0h血糖值+4×0.5h血糖值+3×2h血糖值)。小鼠摘眼球取血后,分離血清,-20℃凍存。按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)血清中胰島素分泌水平,同時(shí)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);血清TC、TG、FFA檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5降血糖、降脂和降血脂作用各組小鼠體質(zhì)量在造模前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),糖尿病小鼠實(shí)驗(yàn)期間攝食量高于正常組(P<0.05),由于攝入大量高熱量的飼料,體質(zhì)量增長(zhǎng)較快,出現(xiàn)腹部肥胖癥狀。陽(yáng)性藥物組及高劑量藥物組可有效降低糖尿病小鼠體質(zhì)量增量(P<0.01或P<0.05),低劑量藥物組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)期間糖尿病模型組顯示持續(xù)的高血糖。高、低劑量藥物組給藥后血糖緩慢下降,與模型組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,尤以高劑量藥物組降血糖作用明顯(P<0.01),且與陽(yáng)性藥物組作用程度相當(dāng)(P<0.01)。各組給予葡萄糖后,各組血糖值都有所升高,但在2h以后,除了模型組,其他各組血糖值都趨向正常。對(duì)比各組間的血糖曲線下面積(AUC)發(fā)現(xiàn),高劑量藥物組和陽(yáng)性藥物組可顯著改善糖尿病小鼠糖耐量(P<0.01),低劑量藥物組則作用稍弱(P<0.05)。見(jiàn)表2。圖1進(jìn)一步說(shuō)明PCS高劑量(400mg·kg-1)的降血糖作用最佳。結(jié)果見(jiàn)表3。從表3胰島素水平可知,各給藥組均無(wú)促胰島素分泌作用。MATTHEWS等在1985年提出的穩(wěn)態(tài)模型法用于評(píng)價(jià)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹胰島素(μU·mL-1)×空腹血糖(mmol·L-1)/22.5。與模型組小鼠比較,各給藥組均可降低糖尿病小鼠胰島素抵抗指數(shù),高劑量藥物及陽(yáng)性藥物組作用更為顯著(P<0.01)。因此,高劑量藥物組的降糖作用可能與改善胰島素抵抗有關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表4。高劑量藥物及陽(yáng)性藥物組可有效降低糖尿病TG、TC、FFA含量(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明400mg·kg-1PCS有著同吡格列酮相當(dāng)?shù)慕笛熜А６?00mg·kg-1PCS僅對(duì)降低TC水平有效(P<0.05),對(duì)TG及FFA均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再次表明PCS高劑量的優(yōu)越性。3tm-ir模型小鼠胰島素抵抗和血脂水平的變化2型糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝疾病,其主要的病理表現(xiàn)為胰島素抵抗和胰島功能的不足,其中胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。因此,尋找改善胰島素抵抗的藥物是目前的研究熱點(diǎn)。胰島素作用受遺傳和環(huán)境因素的影響。高脂飲食的攝入可能是影響胰島素敏感性的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn):高脂飲食能引起小鼠的糖耐量受損、TG、TC、血清胰島素升高及胰島素抵抗指數(shù)上升,具體表現(xiàn)在胰島素刺激的肌肉、脂肪組織攝取葡萄糖的能力下降,以及胰島素抑制肝糖異生能力的下降等,這與臨床上胰島素抵抗2型糖尿病患者的相關(guān)癥狀符合。本研究合并使用小劑量STZ多次注射,在小鼠胰島素抵抗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步抑制其β細(xì)胞功能,成功的建立了T2DM-IR模型,并觀察PCS對(duì)2型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響及可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)初步觀察了PCS對(duì)糖尿病小鼠血糖調(diào)節(jié)的影響,結(jié)果顯示,400mg·kg-1PCS可有效降低小鼠空腹血糖值及體質(zhì)量增長(zhǎng)速率,但不改變攝食量(P>0.05),說(shuō)明降血糖作用并非通過(guò)控制攝食量,而是PCS本身藥理活性所決定的。同時(shí),PCS還可降低糖尿病小鼠血胰島素水平、改善胰島素抵抗及糖耐量等。在空腹血糖下降的同時(shí),空腹胰島素亦明顯下降,提示PCS降血糖是通過(guò)降低高胰島素血癥,增加受體對(duì)胰島素的敏感性而起作用,而沒(méi)有刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素,這在一定程度保護(hù)了胰島β細(xì)胞的功能。此外,400mg·kg-1PCS還可顯著改善T2DM-IR模型小鼠高血脂水平,恢復(fù)TG、TC、FFA的正常水平。T2DM-IR模型小鼠高胰島素與胰島素抵抗可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)TG的分解及FFA進(jìn)入血液循環(huán),并伴隨脂肪細(xì)胞對(duì)FFA吸收下降,導(dǎo)致血中FFA濃度增加造成脂代謝紊亂。胰島素可以阻斷TG在肝組織或者脂肪組織的分解,從而減少血中FFA的濃度,同時(shí)還可以通過(guò)減少環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度來(lái)抑制脂質(zhì)代謝,提示PCS可能通過(guò)改善胰島素抵抗,增加胰島素的敏感性和擴(kuò)大胰島素傳導(dǎo)的效應(yīng)性,進(jìn)而發(fā)揮降低脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂質(zhì)紊亂的作用。綜上所述,PCS能夠在一定程度上降低血糖血脂和血清胰島素水平,阻止胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展,提高機(jī)體的胰島素敏感性,說(shuō)明該中藥作為胰島素增敏劑具有較廣的臨床應(yīng)用前景,但如何增強(qiáng)胰島素敏感性以及促進(jìn)外周組織葡萄