植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其在抗除草劑中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)移植物是指使用重建的dna技術(shù)將優(yōu)良的克隆基因?qū)胫参锛?xì)胞或組織，表達(dá)并獲得新特性的植物。該技術(shù)克服了植物具有的混合限制，允許遺傳因素的范圍無(wú)限擴(kuò)大。物種可以從植物、細(xì)菌、動(dòng)物、遙遠(yuǎn)的地方植物和人類(lèi)獲得的甚至合成物種的通道來(lái)管理。因此，該應(yīng)用非常廣泛。1983年之前，由于卷煙的遺傳改良，遺傳植物的研究和應(yīng)用取得了迅速發(fā)展。從1996年到2004年，世界上的轉(zhuǎn)移植物在18個(gè)國(guó)家種植，面積從1996年的170萬(wàn)公里擴(kuò)大到2004年的8000萬(wàn)公里，增加了47倍。2004年，世界上只有47.5億株植物，是1995年的56倍。雖然轉(zhuǎn)換率植物的安全問(wèn)題與公眾態(tài)度、商業(yè)技術(shù)壁壘以及倫理和宗教等復(fù)雜因素交織在一起，這是一個(gè)高度科學(xué)和技術(shù)的政治和經(jīng)濟(jì)問(wèn)題，已成為世界和國(guó)內(nèi)廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)[2]。我不知道轉(zhuǎn)移植物的發(fā)展前景。1對(duì)后代作物的研究1.1植物目的基因的轉(zhuǎn)引獲得有用的目的基因是基因工程的前提.近幾年來(lái),應(yīng)用于植物的外源基因包括抗病毒、抗蟲(chóng)、抗除草劑、改變蛋白質(zhì)成分含量、雄性不育、改變花色和花形、延長(zhǎng)保鮮期等,并將這些基因分別轉(zhuǎn)入煙草、馬鈴薯、棉花、番茄、大豆、玉米、油菜、苜蓿、矮牽牛等作物.迄今為止,全世界已分離出植物目的基因100余個(gè),獲得轉(zhuǎn)基因植物近200種,已有近1000例轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn),涉及的植物物種有50余個(gè),已批準(zhǔn)了48個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品種進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn).1.1.1抗機(jī)構(gòu)開(kāi)展抗雜草作物選育植物由于轉(zhuǎn)入了抗除草劑基因,表現(xiàn)出抗不同類(lèi)型除草劑的性狀.目前已獲得了一些抗除草劑作物,如抗草丁膦(Glufosinate)轉(zhuǎn)基因作物冬油菜,抗草甘膦(農(nóng)達(dá))轉(zhuǎn)基因作物大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜,抗磺酰脲類(lèi)除草劑轉(zhuǎn)基因作物大豆、棉花,抗溴苯腈轉(zhuǎn)基因作物油菜、小麥、棉花、煙草,抗阿特拉津(Atrazine)轉(zhuǎn)基因作物大豆、玉米,抗唑啉酮類(lèi)除草劑轉(zhuǎn)基因作物玉米、油菜、甜菜、小麥、水稻以及脫鹵素酶轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物.此外,解溴苯腈毒害的BXn基因和解2,4-D毒害的tfDA基因等也在抗除草劑作物選育中獲得成功表達(dá).1.1.2抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化應(yīng)用比利時(shí)植物遺傳公司的科學(xué)家于1987年首次將蘇云金桿菌毒蛋白基因?qū)霟煵葜械靡员磉_(dá),表現(xiàn)出對(duì)1齡煙草夜蛾幼蟲(chóng)的抗性.經(jīng)過(guò)10多年的發(fā)展,已取得較大的進(jìn)展,并實(shí)現(xiàn)了大面積的商業(yè)化應(yīng)用.抗蟲(chóng)基因有兩類(lèi):一類(lèi)是Bt殺蟲(chóng)蛋白基因,來(lái)自蘇云金芽孢桿菌,殺蟲(chóng)毒性為伴孢晶體蛋白,對(duì)鱗翅目、雙翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)有毒,現(xiàn)已導(dǎo)入棉花、玉米、水稻、煙草、番茄、馬鈴薯、胡桃、楊樹(shù)、落葉松等;另一類(lèi)是蛋白酶抑制劑基因,可抑制蛋白酶活性,干擾害蟲(chóng)消化作用而導(dǎo)致其死亡,是植物對(duì)蟲(chóng)害的自衛(wèi)反應(yīng),主要有絲氨酸類(lèi)、半胱氨酸類(lèi)、含金屬類(lèi)、天冬氨酸類(lèi),現(xiàn)已導(dǎo)入棉花、煙草、番茄、龍葵等.根據(jù)轉(zhuǎn)化所使用的基因類(lèi)型,大體可以將抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展過(guò)程分為兩代:第1代即以轉(zhuǎn)入Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因?yàn)橹?其產(chǎn)生的許多轉(zhuǎn)基因作物都已進(jìn)入商品化生產(chǎn),如獲得Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因的煙草和番茄植株;第2代則轉(zhuǎn)入Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白基因之外的高效殺蟲(chóng)蛋白基因,這一代轉(zhuǎn)基因作物大部分還處在實(shí)驗(yàn)室階段,少數(shù)進(jìn)入田間試驗(yàn).抗蟲(chóng)基因在棉花上得到了最成功的應(yīng)用,獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的Bt基因已見(jiàn)諸報(bào)道的有CryIA(b),CryIA(c),CryIIA和CryIVA;涉及的國(guó)家有美國(guó)、中國(guó)、澳大利亞、埃及、法國(guó)、印度、原蘇聯(lián)、泰國(guó)等.目前已獲得轉(zhuǎn)化植株的蛋白酶抑制劑基因有:大豆胰蛋白酶抑制劑基因(SKTI)、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)、慈菇胰蛋白酶抑制劑基因(API)等幾類(lèi);其中獲得轉(zhuǎn)CpTI基因的植物種類(lèi)最多,有蘋(píng)果、油菜、水稻、番茄、向日葵、甘薯、煙草、馬鈴薯等10余種;中國(guó)轉(zhuǎn)CpTI棉花的研究已開(kāi)展多年,并先后獲得了轉(zhuǎn)CpTI基因和轉(zhuǎn)Bt+CpTI雙價(jià)基因棉花,并開(kāi)始了商業(yè)化生產(chǎn).另外,外源凝集素基因(GNA)也至少在油菜、番茄、水稻、甘薯、甘蔗、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆和葡萄等10種植物上獲得了表達(dá),均表現(xiàn)出一定的抗蟲(chóng)性[13~15].1.1.3抗感染基因的轉(zhuǎn)化1986年,美國(guó)Beachy研究小組首次將煙草花葉病毒(TMV)外殼蛋白基因(CP)導(dǎo)入煙草,培育出抗TMV的煙草植株,開(kāi)創(chuàng)了抗病毒育種的新途徑.通過(guò)導(dǎo)入植物病毒的外殼蛋白基因來(lái)提高植物的抗病毒能力的技術(shù),已在多種植物病毒中進(jìn)行了試驗(yàn),如梁小友等將抗病毒的CMV-cp基因和抗蟲(chóng)的Bt-toxin基因?qū)敕?獲得了再生的番茄植株.目前被導(dǎo)入的抗病基因有:抗煙草花葉病毒蛋白基因(MP)、抗白葉枯病基因、抗棉花枯萎病基因、抗煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)基因、小麥抗赤霉病、紋枯病和根腐病基因,并進(jìn)行了抗水稻白葉枯病,花生、番茄青枯病,大白菜軟腐病,柑橘潰瘍病,桑樹(shù)、桉樹(shù)青枯病、根腫病等研究.獲得轉(zhuǎn)基因抗病性狀的植物有:煙草、番茄、棉花、大麥、燕麥草、小麥、馬鈴薯、水稻等.除了外殼蛋白基因這一有效途徑外,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室正在摸索多種抗病毒基因工程的新方法,包括衛(wèi)星RNA,復(fù)制酶基因以及病毒復(fù)制抑制因子,核糖體失活蛋白,致病相關(guān)蛋白,核酸酶等.細(xì)菌病和真菌病的抗病基因工程研究基本上還處于實(shí)驗(yàn)室階段.中國(guó)培育的轉(zhuǎn)基因抗黃瓜花葉病毒甜椒和番茄已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn).1.1.4水稻、煙草基因檢測(cè)目前已分離出大量與抗逆代謝相關(guān)的基因,包括與抗(耐)寒有關(guān)的脯氨酸合成酶基因、魚(yú)抗凍蛋白(AFP)基因、擬南芥葉綠體3-磷酸甘油?；D(zhuǎn)移酶基因,與抗旱有關(guān)的繭蜜糖合成酶基因及一些植物去飽和酶基因等.中國(guó)在抗逆基因的分離、克隆和轉(zhuǎn)化等方面的研究已取得一定進(jìn)展,克隆了耐鹽堿相關(guān)基因,通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化已獲得了耐1%NaCl的苜蓿,耐0.8%NaCl的草莓,耐2%NaCl的煙草,抗逆基因工程作物已進(jìn)入田間試驗(yàn)階段.劉巖等獲得了耐鹽性明顯提高的轉(zhuǎn)基因玉米植株.張荃等獲得了耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因番茄.新疆石河子大學(xué)生物工程部用花粉管通道法將蘆葦和細(xì)菌的耐鹽堿基因?qū)胄←?育成抗鹽堿轉(zhuǎn)基因小麥253,282,221等新品系,耐鹽堿力明顯加強(qiáng).Sakamoto等獲得了兩種耐鹽性和耐寒性均提高的水稻轉(zhuǎn)基因植株.Capell等利用CaMV35S啟動(dòng)子在水稻中過(guò)量表達(dá)Adc,在干旱脅迫下抑制了葉綠素的降解,提高了抗旱性.Steponkus等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入Cor15a的擬南芥的葉綠體和原生質(zhì)體耐寒性提高.Mckersie等將從煙草中克隆的Mn-SOD的cDNA置于35S啟動(dòng)子下轉(zhuǎn)入苜蓿,轉(zhuǎn)基因苜蓿經(jīng)兩個(gè)冬季的田間試驗(yàn)比較,越冬成活率大于未轉(zhuǎn)移植株,平均提高25%.美國(guó)用抗性基因工程技術(shù),育成抗除草劑的大豆、抗凍的草莓等,已用于大田生產(chǎn).美國(guó)斯坦福大學(xué)把仙人掌基因?qū)胄←?、大豆等作?育成抗旱、抗瘠新品種.1.1.5水稻新品種的制備品質(zhì)改良主要涉及蛋白質(zhì)的含量、氨基酸的組成、淀粉和其他多糖化合物以及脂類(lèi)化合物的組成.富含蛋氨酸的轉(zhuǎn)基因煙草、直鏈淀粉含量降低的轉(zhuǎn)基因水稻、月桂酸含量高達(dá)40%的轉(zhuǎn)基因油菜都相繼成功,有的已進(jìn)入大田試驗(yàn).另外,延熟轉(zhuǎn)基因番茄和改變花色轉(zhuǎn)基因玫瑰也已商品化.“金米的故事”(將水仙花的兩個(gè)基因和一種細(xì)菌的一個(gè)基因一起植入一種名叫T309的水稻中,獲得一種水稻新品種.這樣獲得的新水稻富含鐵元素、鋅元素和可轉(zhuǎn)化為維生素A的胡蘿卜素,能防止貧血和維生素A缺乏癥,大米又呈金黃色)表明,轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良大米品質(zhì),解決人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)不良已成為可能.而中國(guó)學(xué)者將玉米醇溶蛋白(Zein)基因?qū)腭R鈴薯后,田間轉(zhuǎn)基因植物的塊莖中必需氨基酸含量提高10%以上,而含硫氨基酸的增加尤為顯著.此外,富含蛋氨酸的轉(zhuǎn)基因煙草,直鏈淀粉含量降低的轉(zhuǎn)基因油菜都相繼成功,有的已經(jīng)進(jìn)入大田試驗(yàn).另外,采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制乙烯合成或促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成的抗早衰基因也已見(jiàn)諸報(bào)道.生物反應(yīng)器生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)基因可用于生產(chǎn)口服疫苗、工業(yè)用酶、脂肪酸、基因藥物等.其比較成功的例子就是利用轉(zhuǎn)基因油菜生產(chǎn)非食用性工業(yè)用油,其中包括制造肥皂等去垢劑的十二碳月桂酸,同時(shí)轉(zhuǎn)基因油菜還被用于生產(chǎn)潤(rùn)滑油和尼龍的原料芥酸以及用于麥淇淋制作的6-十八碳烯酸.此外,轉(zhuǎn)基因植物還用于生產(chǎn)高分子材料如生物可以降解的聚羥丁酯塑料和天然棉花和聚酯的混合纖維等.在所有的目的基因中,諸如抗蟲(chóng)、抗病、抗除草劑等這些為減少投入的性狀常被稱(chēng)為第一代轉(zhuǎn)基因植物性狀,而第二代轉(zhuǎn)基因性狀是指增加產(chǎn)出性狀,如品質(zhì)改良、加工增殖、專(zhuān)用產(chǎn)品、醫(yī)藥保健等,消費(fèi)者更易接受.1.2目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生以來(lái),各種基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法也應(yīng)運(yùn)而生.迄今為止,已經(jīng)建立了多套植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),它們特點(diǎn)各異,分別使用于不同的受體植物.正確選擇轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也便成了實(shí)現(xiàn)某一植物基因轉(zhuǎn)化成功的先決條件.目的基因的遺傳轉(zhuǎn)化是指將外源DNA通過(guò)載體、媒體或其他物理、化學(xué)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞并得到整合和表達(dá)的過(guò)程.實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化的途徑稱(chēng)之為轉(zhuǎn)化系統(tǒng).外源DNA通過(guò)載體介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱(chēng)之為基因載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng).目前已經(jīng)建立了10余種基因轉(zhuǎn)化方法,按轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理進(jìn)行分類(lèi),可以分為三大類(lèi)型:(1)以質(zhì)粒DNA等為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),如農(nóng)桿菌法,迄今為止所獲得的轉(zhuǎn)基因植物中約80%是利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化而來(lái)的;(2)不用任何載體,通過(guò)物理化學(xué)方法直接將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng),如微針注射法、基因槍法;(3)以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細(xì)胞,如花粉?；蚱渌?xì)胞等為媒體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng),如花粉管通道法.23轉(zhuǎn)移作物的應(yīng)用2.1制備基因商品世界第一例轉(zhuǎn)基因煙草1983年在美國(guó)問(wèn)世.1986年,首批轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)和抗除草劑棉花進(jìn)入田間試驗(yàn).值得說(shuō)明的是,1992年中國(guó)成為世界上第一個(gè)商品化種植的國(guó)家,開(kāi)創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因植物商品化應(yīng)用的先河;當(dāng)時(shí)種植的是一種抗黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草.1993年,第一例轉(zhuǎn)基因延熟番茄獲得美國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)種植.1994年,第一個(gè)轉(zhuǎn)基因延熟番茄“FlavrSavr”獲得美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng).自1983年起,在不到20年的時(shí)間里,植物基因工程的研究和開(kāi)發(fā)進(jìn)展十分迅速.2.2全球轉(zhuǎn)基因作物分布情況從全球范圍看,轉(zhuǎn)基因植物的商業(yè)化的成功應(yīng)用集中在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物上,其種植面積和銷(xiāo)售收入成倍增長(zhǎng),發(fā)展迅猛.其概況如下:(1)種植面積:1996年,全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積為170萬(wàn)公頃,之后,每年都有大幅度的增加;1997年為1100萬(wàn)公頃,1998年2780萬(wàn)公頃,1999年3990萬(wàn)公頃,2000年4420萬(wàn)公頃,2001,2002年分別為5260,5870萬(wàn)公頃,至2004年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達(dá)81000萬(wàn)公頃,較2003年增加了20%,是1996年的47倍.(2)4種主要轉(zhuǎn)基因作物種植情況:2004年,種植面積最大的4種轉(zhuǎn)基因作物為:大豆(4840萬(wàn)公頃,占同類(lèi)作物面積的60%),棉花(900萬(wàn)公頃,占同類(lèi)作物面積的11%),油菜(430萬(wàn)公頃、占同類(lèi)作物面積的6%),玉米(1930萬(wàn)公頃、占同類(lèi)作物面積的23%).(3)種植分布:到2004年,已有17個(gè)國(guó)家825萬(wàn)農(nóng)戶(hù)種植轉(zhuǎn)基因作物.4個(gè)主要種植國(guó)為:美國(guó)(4760萬(wàn)公頃、占59%)、阿根廷(1620萬(wàn)公頃,占20%)、加拿大(540萬(wàn)公頃,占6%)、巴西(500萬(wàn)公頃,占6%)、中國(guó)(370萬(wàn)公頃,占5%).其他國(guó)家按面積大小依次為:巴拉圭、印度、南非、烏拉圭、澳大利亞、羅馬尼亞、墨西哥、西班牙、菲利賓、哥倫比亞、洪都拉斯和德國(guó).較2003年的700萬(wàn)農(nóng)戶(hù),2004年新增了125萬(wàn)農(nóng)戶(hù).在這17個(gè)國(guó)家中,有4個(gè)發(fā)達(dá)國(guó)家、11個(gè)發(fā)展中國(guó)家、2個(gè)歐洲國(guó)家.值得一提的是新增國(guó)烏拉圭第一年就種植了120萬(wàn)公頃轉(zhuǎn)基因大豆,相當(dāng)于其國(guó)內(nèi)大豆種植面積的60%.(4)轉(zhuǎn)基因作物種子的銷(xiāo)售情況:1995年,全球轉(zhuǎn)基因作物種子的銷(xiāo)售額(包括一部分技術(shù)費(fèi))為0.84億美元,1996到2002年依次為3.47,11.13,22.59,29.31,30.45,42.50億美元,到2004年增加到47.5億美元,銷(xiāo)售額9年增加了56倍.據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用機(jī)構(gòu)(ISAAA)預(yù)測(cè),2005年,將達(dá)到50億美元;2010年,將達(dá)到200億美元.(5)轉(zhuǎn)基因作物性狀:目前,轉(zhuǎn)基因作物性狀主要集中表現(xiàn)為抗除草劑、抗蟲(chóng)等.2004年共種植轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物5860萬(wàn)公頃,占72%,作物主要為大豆、玉米、棉花;轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)作物1560萬(wàn)公頃,占19%,主要是棉花;抗除草劑加抗蟲(chóng)作物680萬(wàn)公頃,占9%,主要是棉花和玉米,抗病毒及其他轉(zhuǎn)基因性狀種植面積不到1000公頃,低于1%.2.3國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物和水稻種植情況中國(guó)轉(zhuǎn)基因作物研究始于20世紀(jì)80年代,1986年啟動(dòng)的“863”計(jì)劃起了關(guān)鍵性的導(dǎo)向、帶動(dòng)和輻射作用.1997年至2003年12月,農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)安全評(píng)價(jià)申請(qǐng)環(huán)境釋放243項(xiàng),生產(chǎn)性試驗(yàn)108項(xiàng),生產(chǎn)用安全證書(shū)79個(gè);已進(jìn)入環(huán)境釋放階段的轉(zhuǎn)基因植物有:水稻、玉米、小麥、馬鈴薯、河套密瓜、番木瓜、大豆、油菜、楊樹(shù)、煙草、高羊茅、黑麥草;已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物有:棉花(46項(xiàng))、線(xiàn)辣椒(1項(xiàng))、甜椒(4項(xiàng))、矮牽牛(1項(xiàng))、番茄(6項(xiàng)),共計(jì)58項(xiàng).同期,美國(guó)、加拿大和歐盟共計(jì)有14485個(gè)通過(guò)環(huán)境釋放、118個(gè)通過(guò)商品化許可,美國(guó)轉(zhuǎn)基因生物種類(lèi)最多,為106個(gè).在應(yīng)用方面,中國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的研究和開(kāi)發(fā)得到迅猛發(fā)展,是繼美國(guó)之后具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的第二個(gè)國(guó)家,是國(guó)內(nèi)基因工程用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的第一個(gè)成功范例.1998—2003年6年累計(jì)推廣種植超過(guò)8