基于srap技術(shù)的郁金類(lèi)藥材原植物分類(lèi)研究

秋葵是常用的中藥之一。姜科植物的溫玉金c.肉堿c.長(zhǎng)度。廣西莪術(shù)c.k旺西林c.g。商品上分別稱(chēng)為溫郁金、黃絲郁金、桂郁金和綠絲郁金。市場(chǎng)上郁金品種復(fù)雜,僅四川就有黃白絲郁金(川郁金)和白絲郁金入藥。筆者在雙流郁金GAP基地建設(shè)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)由于郁金品種的混亂,傳統(tǒng)粗放的種植模式導(dǎo)致郁金品種退化、病毒化嚴(yán)重、產(chǎn)量低,質(zhì)量不穩(wěn)定;再加上藥材種植的種苗市場(chǎng)混亂,郁金藥材優(yōu)質(zhì)種苗難尋,導(dǎo)致郁金藥材的品種混亂,品質(zhì)、產(chǎn)量下降。而且姜黃屬植物的親緣關(guān)系、系統(tǒng)分類(lèi)和中藥鑒定一直存在很大的爭(zhēng)議。有專(zhuān)家認(rèn)為川郁金為姜黃的栽培變種;有的專(zhuān)家認(rèn)為溫郁金和川郁金關(guān)系密切;也有專(zhuān)家認(rèn)為川郁金可定為一個(gè)單獨(dú)的種。因此對(duì)郁金的種質(zhì)資源進(jìn)行研究非常必要。SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)技術(shù)為L(zhǎng)i等發(fā)展的一種新標(biāo)記,該標(biāo)記具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、便于克隆目標(biāo)片段的特點(diǎn),已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)和遺傳多樣性分析中,如水稻、油菜和大蒜等植物的分析研究中。本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用SRAP技術(shù)對(duì)郁金類(lèi)藥材進(jìn)行了分析研究,擬為郁金類(lèi)中藥的分類(lèi)學(xué)研究、種質(zhì)資源和遺傳多樣性以及GAP研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1從各道地藥材產(chǎn)地引種至清道地藥材基地的栽培供試材料為新鮮葉片,樣品均系筆者于2000—2001年分別從各道地藥材產(chǎn)地引種至四川省雙流縣金橋鎮(zhèn)舟渡村郁金GAP生產(chǎn)種源基地栽培而得,見(jiàn)表1。1.2低溫離心和聚合酶梯度PCR儀:BiometraTgradient;垂直電泳儀:Sequin—GenGT;低溫離心機(jī):Hettich-Universal32R;低溫離心機(jī):Eppendorf5804R。TaqDNA聚合酶:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;SD002NDAMarker:參照片段19325、600、500、400、300、200、100,北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;引物:由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.3提取dns采用CTAB法,略有改動(dòng)。提取出的DNA用TE200μL溶解,存于-20℃冰箱備用。1.4引用材料設(shè)計(jì)根據(jù)Li等發(fā)表的引物,設(shè)計(jì)了10個(gè)上游引物(ME1~ME10)和10個(gè)下游引物(EM1~EM10),見(jiàn)表2。1.5pcr擴(kuò)增程序反應(yīng)體系20μL:DNA2μL(30ng/μL),10×PCRbuffer2μL,MgCl22μL(25mmol/L),dNTP2μL(2mmol/L),上游引物2μL,下游引物2μL,Taq酶0.2μL(5U),H2O補(bǔ)足總體積20μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃變性5min;開(kāi)始5個(gè)循環(huán)94℃變性1min,35℃復(fù)性1min,72℃延伸1min;然后35個(gè)循環(huán)94℃變性1min,50℃復(fù)性1min,72℃延伸1min;72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(6%,7mol/L尿素)分離,電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳時(shí),先用120W電流電泳預(yù)熱30min,上樣后70~90W電流電泳2h左右,當(dāng)二甲苯青FF跑過(guò)2/3膠板時(shí)中止電泳,銀染。2黃漢郁金的結(jié)構(gòu)表征2.1用1號(hào)和3號(hào)樣品對(duì)100個(gè)引物組合進(jìn)行篩選,選取出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶信號(hào)強(qiáng)、重現(xiàn)性好、特征性好的27個(gè)引物組合。27個(gè)引物組合分別是:ME-1/EM-1、ME-1/EM-2、ME-1/EM-3、ME-3/EM-1、ME-3/EM-2、ME-3/EM-3、ME-3/EM-4、ME-3/EM-5、ME-3/EM-6、ME-3/EM-7、ME-3/EM-8、ME-3/EM-9、ME-4/EM-3、ME-4/EM-9、ME-4/EM-10、ME-5/EM-1、ME-5/EM-2、ME-5/EM-3、ME-5/EM-4、ME-5/EM-5、ME-5/EM-6、ME-5/EM-7、ME-6/EM-2、ME-6/EM-3、ME-6/EM-4、ME-6/EM-5、ME-6/EM-7。用27個(gè)引物組合對(duì)9個(gè)郁金材料進(jìn)行擴(kuò)增,電泳后,共得到847條條帶,其中多態(tài)性條帶397條,每個(gè)引物組合的總條帶數(shù)從20~64條不等,多態(tài)性條帶數(shù)從7~25條不等。平均每個(gè)引物組合產(chǎn)生14.7條多態(tài)性條帶,見(jiàn)圖1。2.2采用Baroni-Urban聚類(lèi)系數(shù),WPGMA聚類(lèi)方法,在DPS統(tǒng)計(jì)分析軟件上運(yùn)用0-1聚類(lèi)分析方法,獲得了距離矩陣和聚類(lèi)分析圖。見(jiàn)表3,圖2。2.3分子生物學(xué)研究結(jié)合原植物形態(tài)可見(jiàn),當(dāng)取分類(lèi)閾值λ1=0.51時(shí),供試的6個(gè)品種郁金可分為2個(gè)大組,一組為黃絲郁金和黃白絲郁金(簡(jiǎn)稱(chēng)Ⅰ組),另一組為綠絲郁金、白絲郁金、桂郁金和溫郁金(簡(jiǎn)稱(chēng)Ⅱ組)。從原植物形態(tài)來(lái)看,這兩組的主要區(qū)別在于花序的出生部位。Ⅰ組花序從葉鞘內(nèi)抽出,Ⅱ組花序直接從根莖抽出(僅白絲未見(jiàn)花)。在經(jīng)典植物分類(lèi)文獻(xiàn)上,花序出生的部位非常重要,常常作為分類(lèi)的重要依據(jù)。其次在主根莖和側(cè)根莖橫切面的顏色上兩組也有區(qū)別,Ⅰ組主根莖和側(cè)根莖顏色均為橙紅色和橙色,Ⅱ組的顏色為墨綠色或黃綠色。2.4黃白絲郁金和黃絲郁金:黃絲郁金和黃白絲郁金主要分布于四川雙流、崇州、犍為等地,黃白絲郁金常與黃絲郁金混生,其塊根在當(dāng)?shù)爻１划?dāng)作黃絲郁金入藥。黃白絲郁金植株比較高大,根莖比較發(fā)達(dá),根入土較深;黃絲郁金的植株比較矮小,根莖發(fā)達(dá),根入土較淺。但兩者花序均從葉鞘內(nèi)抽出,葉片兩面均無(wú)毛,主根莖和側(cè)根莖橫切面的顏色相近,為橙紅色和橙色。故兩者具有非常近的親緣關(guān)系,筆者認(rèn)為黃白絲郁金(川郁金)應(yīng)為姜黃C.longaL.即黃絲郁金的栽培變種C.longaL.cv.chuanyujin。2.5白絲郁金與綠絲郁金:從SRAP研究結(jié)果可見(jiàn)白絲郁金和綠絲郁金有很近的親緣關(guān)系,在分類(lèi)閾值為0.22時(shí),兩個(gè)品種可以相互聚合。在生長(zhǎng)環(huán)境上白絲郁金常與綠絲郁金混生在一起。認(rèn)為白絲郁金可能為蓬莪術(shù)C.phaeocaulis即綠絲郁金的栽培變種,暫定為白絲郁金C.phaeocaulisVal.cv.baisi。3引物篩選及響應(yīng)程序優(yōu)化多態(tài)性條帶的篩選SRAP技術(shù)是一種新型標(biāo)記,現(xiàn)主要用在水稻、油菜和大蒜等植物研究中。本文首次將該技術(shù)應(yīng)用到中藥研究領(lǐng)域中來(lái),研究中通過(guò)引物的篩選、反應(yīng)程序的