第五章光譜分析法匯報(bào)人：某某某匯報(bào)時(shí)間：2023.X.X紫外－可見分光光度法熒光分析法原子吸收分光光度法常用的光譜分析法1.紫外可見分光光度法用于體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速

缺點(diǎn)：專屬性差、靈敏度低（10-7g/mL）一、紫外可見分光光度法（UV－Vis）

Ultraviolet-visibleSpectrophotometry

2.UV－Vis法原理和影響分析的因素（1）原理：Lambert－Beer定律（單色光）

在定量分析時(shí)，特別強(qiáng)調(diào)的是在一定的濃度范圍內(nèi)和給定的波長條件下測(cè)定，Lambert-Beer定律才成立。否則產(chǎn)生對(duì)該定律的偏離。譜帶寬度、溶液的pH、被測(cè)物在溶劑中發(fā)生締合、解離或溶劑化等因素均可使直線偏離，在測(cè)定過程中都會(huì)產(chǎn)生誤差，均需引起注意。3.體內(nèi)藥物UV－Vis分析法的建立（1）靈敏度較低藥物的吸光強(qiáng)度與其實(shí)際欲測(cè)血藥濃度是否匹配。藥物名稱溶劑λ(nm)A=0.4時(shí)濃度（10-6g）有效血藥濃度（10-6g）乙酰水楊酸0.1HCl229434920—300茶堿0.1HCl27245496--20異戊巴比妥0.1NaOH244365111--4咖啡因0.1HCl27549081--8氯丙嗪0.1HCl25610354150苯妥因鈉MeOH2582913810--20異煙肼0.1HCl2654209.55--15利多卡因0.1HCl235401001.5-7磺胺嘧啶0.1HCl2425976.7100-150甲磺丁脲EtOH228500850-100部分藥物和有效治療濃度（2）專屬性較差萃取、純化計(jì)算分光光度法進(jìn)行“數(shù)學(xué)分離”：差示分光光度法雙波長法導(dǎo)數(shù)分光光度法例1

差示分光光度法測(cè)定血漿中的水楊酸水楊酸在不同pH條件下的紫外吸收光譜有顯著差異，而血漿中的雜質(zhì)在不同pH下紫外吸收光譜不變。水楊酸

C7H6O3∵ANaHCO3＝A水楊酸＋A雜質(zhì)AH2SO4＝A水楊酸′＋A雜質(zhì)′且A雜質(zhì)＝A雜質(zhì)′∴ΔA＝AH2SO4-ANaHCO3∝C水楊酸

可用于測(cè)定水楊酸血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取空白血槳0.5ml分置5支10ml具塞離心管中，依次在每管中加入水楊酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1mg/ml）0.10、0.15、0.20、0.25、0.30ml，混勻。各加入2滴0.25mol/LH2SO4并振搖1min使酸化，再各加入2.0ml二氯甲烷,渦旋混勻，離心（2500r/min）15min。用滴管吸去上清液及血塊，精密吸取二氯甲烷層1ml至潔凈試管中，精密加入5%NaHCO310ml反提。各精密吸取反提液4ml，分置成對(duì)的試管中形成兩個(gè)等濃度系列，其中一個(gè)系列加入0.3ml的5%NaHCO3；另一個(gè)系列逐滴小心加入濃H2SO40.3ml，搖勻，超聲處理10分鐘消去氣泡。取上述五組濃度相同，pH不同的溶液，在244nm處分別測(cè)定差示吸收值（

A）。以濃度C為橫坐標(biāo)，以差示吸收值

A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行回歸，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。血藥濃度測(cè)定精密量取0.5m1血漿樣品按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”項(xiàng)下操作，測(cè)得

A樣，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或根據(jù)回歸方程求出血藥濃度?？瞻籽獫{與血漿樣品的來源應(yīng)一致兩個(gè)不同pH系列的操作必須遵循平行操作原則討論例2兔血清中氨茶堿的雙波長分光光度法測(cè)定

茶堿血漿蛋白結(jié)合率高，個(gè)體差異大，且治療血藥濃度較窄（5～20

g/ml），血藥濃度高于25

g/ml時(shí)常出現(xiàn)中毒癥狀，因此要加強(qiáng)臨床血藥濃度的監(jiān)測(cè)工作。原理：茶堿的λmax＝274nm空白血清A274≠0;但空白血清在A298＝A274

因此以274nm為測(cè)定波長，298nm為參比波長，雙波長分光光度法測(cè)定氨茶堿血藥濃度。

△A與茶堿濃度有良好線性關(guān)系。空白血清不存在干擾，每次測(cè)定時(shí)無需用空白血清校正，這樣在治療監(jiān)測(cè)中，避免了取空白血清的麻煩。血清樣品的制備吸取血清樣品0.5ml置離心管中，加0.1mol/L鹽酸溶液0.2ml，精密加入三氯甲烷∶異丙醇（95∶5）溶液5ml，振搖混合，離心（2500r/mim）10min，吸取三氯甲烷液（下層）4.0ml置另一離心管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0ml，振搖均勻，離心（2500r/mim），吸取堿液（上層）3～3.5ml，供測(cè)定用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5mg/ml）5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0

l加入空白血清0.5ml中混勻，使其濃度為5、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0

μg/ml，按“樣品的制備”方法操作，以0.1mol/LNaOH溶液為參比，于274nm和298nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算△A。以△A為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或進(jìn)行回歸，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。血藥濃度測(cè)定以0.1mol/LNaOH溶液為參比，吸取上層堿液3～3.5ml為樣品，于274nm和298nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算△A樣。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或根據(jù)回歸方程求出血藥濃度。例3導(dǎo)數(shù)分光光度法

二、熒光分析法（Fluoromertry）某些物質(zhì)受激發(fā)光（紫外光或可見光）照射后能發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，激發(fā)光停止照射后，光線隨之消失，這種光稱為熒光，為發(fā)射光。特點(diǎn)：

*靈敏度高（10-10~10-12g/mL）

靈敏度高，易受干擾，須做空白

*選擇性好

*稀溶液中濃度與熒光強(qiáng)度成正比

只有在很稀的溶液中，即當(dāng)ECl≤0.05時(shí)，

熒光強(qiáng)度與被測(cè)物濃度間的關(guān)系才成正比關(guān)系：

F＝2.3kφf

I0ElC（一）定量依據(jù)：K（二）影響熒光強(qiáng)度的因素內(nèi)因:分子結(jié)構(gòu)1.長共軛結(jié)構(gòu)

π鍵的共軛度↑→λex和λem長移，熒光效率↑2.分子的剛性和共平面性↑→λex和λem長移，熒光效率↑3.取代基作用給電子基團(tuán)→熒光↑；吸電子基團(tuán)→熒光↓

外因:1.溫度溫度↑→熒光↓2.溶劑極性↑→熒光↑，粘度↓→熒光↓3.pH主要影響弱酸、弱堿物質(zhì)4.熒光猝滅劑如鹵素離子、重金屬離子等5.激發(fā)光會(huì)造成熒光物質(zhì)分解，快速測(cè)定6.散射光波長與熒光波長接近，對(duì)測(cè)定有干擾（三）方法與應(yīng)用1.常規(guī)熒光分析法例1熒光分光光度法測(cè)定血清中諾氟沙星濃度（直接法）

測(cè)定條件選擇：20μg/ml諾氟沙星水溶液

λex＝335nm;λem＝450nmpH4～5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液（200μg/ml）1、2、5、10、20、30、40μl，分別加入健康人血清1.0ml，搖勻，加10％三氯醋酸3.0ml，在液體快速混合器上振蕩1min，離心（3000r/min）5min。取上清液3.0ml，加1mol/LNaOH1.32ml，pH4.5醋酸－醋酸鈉緩沖液0.5ml，搖勻，測(cè)定熒光強(qiáng)度，同時(shí)取空白血清同法操作做空白校正，經(jīng)回歸分析得線性方程。線性范圍0.2～8μg/ml血藥濃度測(cè)定取血清1.0ml，加10％三氯醋酸3.0ml，在液體快速混合器上振蕩1min，離心（3000r/min）5min。取上清液3.0ml，加1mol/LNaOH1.32ml，pH4.5醋酸－醋酸鈉緩沖液0.5ml，搖勻，測(cè)熒光強(qiáng)度，同時(shí)以標(biāo)準(zhǔn)管對(duì)照，計(jì)算血藥濃度。2.間接測(cè)定法化學(xué)引導(dǎo)熒光法

利用化學(xué)方法可以使一些本身不能產(chǎn)生熒光的化合物轉(zhuǎn)變成熒光化合物，并且改善了方法的選擇性。反應(yīng)機(jī)理：改變了分子結(jié)構(gòu)，增加了π電子共軛系統(tǒng)的長度或增加了分子結(jié)構(gòu)的剛性和共平面性，從而增加了熒光強(qiáng)度。常用的化學(xué)處理方法主要有下面幾類：1.氧化還原反應(yīng)

例1嗎啡在弱堿性條件下可被鐵氰化鉀氧化成比其本身熒光強(qiáng)得多的二聚物偽嗎啡。測(cè)定體內(nèi)嗎啡含量，可將提取純化后的水溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，加入K3Fe(CN)6使其反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度（λex350nm，λem440nm），線性范圍0.1－8.0μg/ml。λex350nm，λem440nm

例2苯妥因在堿性條件下可被高錳酸鉀氧化成二苯酮，在濃H2SO4作用下產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光：（λex360nm，λem490nm）。

先用二氯乙烷萃取，NaOH溶液轉(zhuǎn)溶后，KMnO4氧化，正己烷萃取，濃H2SO4回提，然后測(cè)定熒光。λex360nm，λem490nm

例3體液中甲基多巴的測(cè)定可用K3Fe(CN)6氧化，產(chǎn)物經(jīng)堿化、重排生成具有強(qiáng)熒光的二羥基吲哚類化合物，在λex400nm，λem510nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。例4尿液中維生素B1的測(cè)定可利用其在堿性溶液中被K3Fe(CN)6氧化成硫色素，用正丁醇萃取，有機(jī)層顯強(qiáng)藍(lán)色熒光。

λex365nm，λem435nm。例5苯駢噻嗪類藥物經(jīng)過氧化氫、高錳酸鉀等氧化劑作用可生成亞砜結(jié)構(gòu)，具有強(qiáng)熒光，可用于測(cè)定體液中微量藥物。λex340nm，λem380nm。2.水解反應(yīng)

例1氨芐青霉素在pH2的緩沖液中，以甲醛為催化劑，90℃加熱2小時(shí)，水解生成具有強(qiáng)烈黃色熒光的化合物。經(jīng)溶劑萃取，再轉(zhuǎn)溶于1mol/LNaOH溶液中，測(cè)定熒光強(qiáng)度（λex346nm，λem422nm）。生成的熒光產(chǎn)物可能是哌嗪二酮衍生物。λex392nmλem478nm3.縮合反應(yīng)

例1血清中異煙肼的測(cè)定，可利用其在醋酸酸性溶液中與水楊醛縮合成腙，經(jīng)巰基乙醇還原后有強(qiáng)烈熒光。

λex392nm，λem478nm，

最低檢出濃度：0.01μg/ml例2色胺和5－羥色胺與甲醛縮合，生成的化合物，經(jīng)氧化后生成一個(gè)發(fā)強(qiáng)熒光的“norharman”

λex365nm，λem440nmλex365nm，λem440nm4.絡(luò)合反應(yīng)

例四環(huán)素類與Ca2+及巴比妥鹽形成具有熒光的絡(luò)合物，經(jīng)有機(jī)相萃取后，測(cè)定。巴比妥參與絡(luò)合使生成物脂溶性增加，易被萃取。光化學(xué)反應(yīng)熒光分析法（photochemicalfluorescencespectroscopy,PCF）

基于物質(zhì)吸收了紫外可見輻射而引起光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)或性質(zhì)發(fā)生了某些變化，造成熒光增強(qiáng)或猝滅及波長發(fā)生移動(dòng)等現(xiàn)象，從而使物質(zhì)的熒光性質(zhì)得到改善，提高它的靈敏度和選擇性。特點(diǎn)：

①光化反應(yīng)容易誘導(dǎo)高環(huán)系化合物生成，某些非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)經(jīng)光照后，分子剛性增強(qiáng)，熒光量子產(chǎn)率顯著提高。如：用紫外光照射二己烯酚（DES），使環(huán)合成強(qiáng)熒光物質(zhì)二己烯酚（DES）光照后環(huán)合成強(qiáng)熒光物質(zhì)②入射光波長不同，會(huì)誘發(fā)不同的光化反應(yīng)。這種反應(yīng)專一性將提高分析方法的選擇性。

③光子加入體系，不會(huì)引入雜質(zhì)，不會(huì)稀釋試樣，可避免加入化學(xué)試劑帶來的許多不利因素。④許多光化反應(yīng)是通過游離基進(jìn)行的，反應(yīng)速率高，完全，有利于在線分析。

這些特點(diǎn)無疑對(duì)體內(nèi)藥物分析是非常有利的。體內(nèi)藥物分析中的應(yīng)用

①苯駢二氮雜卓類：氯羥安定在0.2mol/LNaOH介質(zhì)中，經(jīng)光照生成芳香性更強(qiáng)的異構(gòu)體，熒光強(qiáng)度顯著提高。人血清中氯羥安定檢測(cè)限為0.3μg/ml。

氯氮卓（利眠寧）的測(cè)定是在pH為4.2的緩沖液中，置紫外（汞燈）燈下12cm處照射40min，取出后空氣中平衡10min。

λex265或370nm，λem442nm，

濃度0～3.00μg呈良好線性。

氯氮卓光照前后的光譜圖λex265或370nm，λem442nm②吩噻嗪類

該類藥物廣泛用于治療精神病。血清及尿液中吩噻嗪的常規(guī)測(cè)定方法缺乏足夠的靈敏度。由于它是一類光活性物質(zhì)，光氧化可使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，發(fā)射波長長移，方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，檢測(cè)限可達(dá)ng/ml級(jí)。③其它

大麻酚本身是非熒光物質(zhì)。經(jīng)光照開環(huán)，H轉(zhuǎn)移，去H，最后閉環(huán)生成強(qiáng)熒光物質(zhì)羥氫菲。用HPLC－PCF分析尿中大麻酚，檢出限低于1ng。PCF在體內(nèi)藥分中的應(yīng)用被測(cè)物試樣檢測(cè)限被測(cè)物試樣檢測(cè)限VK1血清30pg氯羥安定血清尿0.3μg/ml乙醇4ng氯芪酚胺血清尿60pg丙醛4ng大麻酚尿1ngclobazam血尿70pg伯氨喹血清0.9ngDesmethy-Clobazam血尿120pg麥角堿尿DES血，尿1ng/ml熒光衍生化反應(yīng)

用熒光衍生化試劑（也稱熒光探針）與本身無熒光或熒光效率低的化合物反應(yīng)，使其產(chǎn)物具有強(qiáng)熒光。從而大大提高檢測(cè)靈敏度。對(duì)熒光試劑的要求主要有：

①在溫和條件下，最好在水或含水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)。

②生成物有高的熒光效率，發(fā)射光波長在較長波長處，溶劑的本底熒光不影響測(cè)定。

③反應(yīng)產(chǎn)物極性小，易于用有機(jī)溶劑提取、分離或濃集。

④試劑反應(yīng)有專屬性。用于伯胺、仲胺及具有潛在胺基藥物。pH8-9的水溶液，室溫反應(yīng)生成強(qiáng)熒光的吡咯啉酮衍生物。λex390nm

λem486nm。1.胺類用試劑－熒光胺（Fluorescamine）

例尿中氯氮卓可利用其水解產(chǎn)物三甲胺和胺熒反應(yīng)

方法是：尿樣中加pH7.4的磷酸鹽緩沖液和NaCl固體，以異戊醇－已烷（1.5:98.5）萃取。萃取液經(jīng)0.45mol/LNaOH洗滌，再以1.5mol/LHCl回提，然后水浴加熱水解，NaOH中和，加入pH9.5的硼酸鹽緩沖液及熒胺試劑，反應(yīng)后測(cè)F值。

②丹酰氯（Dansylchloride）

用于含－NH2、－NH－、－OH、－CO－的藥物分析。如：可用于測(cè)定ng水平上的嗎啡、可待因、吐根等生物堿類藥物。③鄰苯二醛（OPA）