第二章抗生素微生物檢定技術

第二節(jié)概述一、抗生素的定義和命名1、抗生素的定義：抗生素是生物（包括微生物、植物、動物）在其生命活動過程中產生的（或并用化學、生物或生化方法衍生的），能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物機能的化學物質的總稱。2、抗生素定義的不斷演變過程1929年Flemming發(fā)現(xiàn)了青霉素，1942年鏈霉素的發(fā)現(xiàn)者定義抗生素為：微生物代謝產生的具有抑制它種微生物生長活動甚至殺滅它種微生物的化學物質。之后隨著生物工程技術的不斷發(fā)展，不斷有新的抗生素被發(fā)現(xiàn)，而且其來源不僅局限于微生物，植物和動物也能產生抗生素；其作用范圍也遠遠超出了抗菌范圍，比如：抗腫瘤細胞的博萊霉素、阿霉素；抗原蟲的巴龍霉素；抵制酶活力的抑胃酶素及抑淀粉酶素等；目前還發(fā)現(xiàn)有一些抗生素除抗生作用外，還有其它的作用，如新霉素、兩性霉素B等具有降低膽固醇的作用；辛伐他丁、洛伐他丁等有降血脂作用；環(huán)孢素有抑制免疫作用可用于器官移植的抗排異反應等。因此，不能把抗生素僅看成是抗菌藥物。2、抗生素的命名：

現(xiàn)沒有統(tǒng)一的命名方法，基本遵守三條規(guī)則：

（1）動植物或菌類產生的抗生素，根據(jù)動物學、植物學或菌屬的名稱而定。如：青霉素、鏈霉素、灰黃霉素等；（2）抗生素的化學結構或性質已經明確了的可根據(jù)其族命名。如：四環(huán)素、氯霉素等；（3）對一些有紀念意義的或按抗生素產生菌的發(fā)現(xiàn)地命名及習慣上已采用俗名的，如：土霉素、平陽霉素等。二、抗生素的分類（一）按來源分：1、細菌產生的：主要有桿菌肽、多粘菌素等；2、真菌產生的：主要有青霉素、頭孢菌素、灰黃霉素等；3、放線菌產生的：主要有鏈霉素、四環(huán)素類、紅霉素、慶大霉素等。（二）按抗生素的作用對象分類：1、抗革蘭氏陽性菌的：如，青霉素、林可霉素、克林霉素、萬古霉素、新霉素等；2、抗革蘭氏陰性菌：主要有鏈霉素、多粘菌素E等；3、廣譜抗生素：如，四環(huán)素類、紅霉素、氯霉素、卡那霉素、頭孢菌素類等；4、抗真菌類：主要有制霉菌素、灰黃霉素、兩性霉素B等；5、抗腫瘤類：主要有平陽霉素、柔紅霉素、放線菌素D、阿霉素等；6、抗病毒及抗原蟲類：主要有抗病毒霉素、曲古霉素、巴龍霉素等；7、抗結核分枝菌類：主要有鏈霉素、環(huán)絲氨酸、利福霉素等。（三）按抗生素化學結構分類：1、β-內酰胺類抗生素：如青霉素類、頭孢菌素類及其衍生物。2、四環(huán)素類抗生素：如四環(huán)素、土霉素、金霉素及其衍生物。3、氨基糖苷類抗生素：如鏈霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、巴龍霉素等。4、大環(huán)內酯類抗生素：如紅霉素、柱晶白霉素、螺旋霉素、羅紅霉素、阿霉素等。5、多烯類抗生素：如制霉菌素、兩性霉素B、曲古霉素等。6、多肽類抗生素：如多粘菌素、桿菌肽、卷曲霉素等。7、苯羥基胺類抗生素：如氯霉素、甲砜氯霉素、已酞氯霉素等。8、蒽環(huán)類抗生素：如柔紅霉素、阿霉素、紫紅霉素等。9、其他抗生素：如磷霉素、環(huán)絲霉素、硫霉素等。（四）按作用機制分類：1、抑制細胞壁合成的：如青霉素、頭孢菌素類、萬古霉素、桿菌肽和環(huán)絲氨酸等。2、影響細胞膜功能的抗生素：如多粘菌素、制霉菌素、兩性霉素B等。3、抑制和干擾細胞蛋白質合成的抗生素：如四環(huán)素類抗生素、氨基糖苷類抗生素（慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素），大環(huán)內酯類抗生素（如紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素）、氯霉素等。4、抑制細胞核糖核酸合成的抗生素5、抑制細菌生物能作用的抗生素三、抗生素效價標示量抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。通常用效價來表示。而抗生素效價的標示量，原則上應按所含特定的抗菌活性部分的重量來計算。但有的是多組分的，有的是按照習慣形成計量單位的。強求一致會影響臨床使用量的計算，因此，采取符合客觀實際的效價標示方法。大致分四類：（一）“活性”重量單位：以抗生素所含特定的抗菌活性部分的重量作為效價單位。如堿性抗生素以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素以純酸的量作為有效部分的量。如阿莫西林鈉和阿莫西林三水酸都是以阿莫西林作為活性單位。（二）類似重量單位：類似重量單位，其中包括了無效的部分，如：純粹的金霉素鹽酸鹽及四環(huán)素鹽酸鹽。（三）重量折算單位：以特定的純抗生素制品的某一重量為1單位而加以折算。如青霉素G鈉，以青霉素單位表示其活性單位，其最初定義為：1個青霉素效價單位（u）為能在50ml肉湯培養(yǎng)基中完全抑制金黃色葡萄球菌標準菌珠發(fā)育的最小青霉素劑量。第一批青霉素國際標準品，青霉素G鈉稱重0.6μg為1u，1667u/mg；第二批1670u/mg。多粘菌素B堿1μg指定為10單位。（四）特定單位：用于成分復雜的抗生素。如桿菌肽。四、抗生素微生物檢定用標準品抗生素微生物效價測定用的標準品，是具有一定物理化學性質及一定的生物活性的物質。分為國家標準品或暫行標準品。國家標準品是使用時間較長而又成熟的抗生素，暫行標準品是新的抗生素。國家標準品由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一制備管理。五、抗生素微生物檢定法可分為：稀釋法、濁度法、擴散法管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法[1]，利用管碟法測定抗生素效價，具有準確、直觀、重復性好等優(yōu)點，因而被廣泛采用。但是整個試驗過程中影響結果的因素很多，任何一個環(huán)節(jié)操作不當或者忽略就會造成很大誤差，導致整組試驗失敗。根據(jù)實際操作中的積累經驗，對管碟法中影響試驗結果的因素進行如下分析及提出解決的方法。

1.實驗器材的準備1.1實驗器材的選擇試驗應該選擇底面平整的玻璃雙碟，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度?？蓪㈦p碟放置在水平臺上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍墨水，根據(jù)藍色是否深淺一致來判斷雙碟底面平整程度。牛津杯則應該選擇加工精細的同一批產品，這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致，使得牛津杯在培養(yǎng)基中下陷相同的深度，抗生素溶液擴散均勻有可比性。如果牛津杯兩端不夠平，就應予剔除，否則會使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴散現(xiàn)象。1.2實驗器材的清洗抗生素試驗中，玻璃雙碟、牛津杯往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。160℃干熱滅菌2h后備用。

2.配制試驗所需的樣品、標準品、緩沖液與培養(yǎng)基2.1樣品與標準品溶液的配制標準品與樣品從冰箱取出后，使與室溫平衡。供試品應放于干燥器內至少30min方可稱取。稱量最好為一次取樣稱量，動作迅速，不得反復稱取，取樣后立即將稱量瓶瓶蓋蓋好，以免吸水。標準品的稱量最好用1/100,000克的分析天平，樣品稱量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥劑應保持經常注意更換。稱量結束后，加入超聲波處理后的磷酸緩沖液，定容至刻度，過濾并稀釋。稀釋時，都應采用容量瓶，每一步稀釋取樣量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把刻度吸管外壁多余液體擦去，再從起始刻度開始放溶液。把稀釋后的抗生素溶液分裝至干燥滅菌試管待用。在稱量抗生素樣品過程中，操作者的工作服上有可能會沾染抗生素粉末，在配培養(yǎng)基、加底層培養(yǎng)基、加菌層培養(yǎng)基或滴加抗生素溶液時，會隨衣袖的抖動落入培養(yǎng)基，造成破圈或者無抑菌圈。所以配制抗生素溶液應單獨使用一套工作服。2.2培養(yǎng)基與緩沖液的配制配制培養(yǎng)基與緩沖液時要按照文獻的配比用量，配制后調節(jié)其pH值。因為在pH值、鹽濃度的影響下，即使瓊脂培養(yǎng)基上的兩個相鄰的小管距離足夠，還是可能會出現(xiàn)卵圓形抑菌圈。例如四環(huán)素易受pH值影響，鏈霉素易受鹽濃度影響[2]。培養(yǎng)基可以購買廠家生產的產品，因為大批量產品中的成分配比較穩(wěn)定，可比性較強。116℃濕熱滅菌20min后備用。

3.加注培養(yǎng)基3.1加注底層培養(yǎng)基無菌室工作臺面可能因為使用時間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會影響培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。在雙碟底部預先標記樣品的高低濃度區(qū)域，在加注培養(yǎng)基底層的時候，有順序地按照一致方向排列。接下來加注培養(yǎng)基菌層的時候，仍然按照原來的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養(yǎng)基菌層是在水平的培養(yǎng)基底層上鋪開，達到消除誤差的目的。試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內部結塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注60～80℃的培養(yǎng)基底層之后，不應立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。3.2加注培養(yǎng)基菌層制備瓊脂培養(yǎng)基菌層時，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時間太長都會導致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至會出現(xiàn)無菌生長。因此，培養(yǎng)基應放在50℃水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后，應盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗的時候，如果從大瓶內用刻度吸管吸取帶菌培養(yǎng)基，吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開，導致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養(yǎng)基分裝在具塞試管內，每管5mL，濕熱滅菌后放在50℃水浴鍋內保溫。試驗中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續(xù)保溫5min使培養(yǎng)基溫度回升，然后直接倒在底層培養(yǎng)基上，轉動雙碟使培養(yǎng)基均勻鋪開。

4.放置牛津杯放置牛津杯時，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀?？稍谠囼炃霸陔p碟的底上用尺測量，作好標記，試驗中可以按照雙碟底面標記放置牛津杯，避免放置位置不恰當產生的問題。牛津杯放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。5.滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二劑量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三劑量法）的順序滴加[3]。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生素到牛津杯的時候，由于毛細管內抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，毛細管口應避免太細，滴加的時候離開牛津杯口距離不要太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入牛津杯后，沒有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這樣是不會產生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出牛津杯內的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加?？股厝芤旱渭雍螅好鎽撆c牛津杯管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴計算，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。

6.雙碟中菌株的培養(yǎng)滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運到培養(yǎng)箱的過程中，可以預先在培養(yǎng)箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養(yǎng)箱，緩慢推入箱內。雙碟在37℃下培養(yǎng)約16h。時間太短會造成抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生素的敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續(xù)生長，使得抑菌圈變小。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻（過于接近熱源），會造成同一雙碟上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養(yǎng)中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應經常注意溫度，防止意外過冷過熱。7.抑菌圈測量7.1試驗結果中抑菌圈直徑不應該過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預試驗，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度為試驗用濃度（菌液濃度約為106個/ml）。批量試驗中后期，菌液保存的時間過久，菌株就會逐漸衰亡，生長周期不一致，影響其對抗生素的敏感度，導致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。7.2用游標卡尺測量抑菌圈直徑，可以在雙碟底部墊一張黑紙，在燈光下測量。不宜取去牛津杯再測量，因為牛津杯中殘余的抗生素溶液會流出擴散，使抑菌圈變得模糊。不能把雙碟翻轉過來測量抑菌圈直徑，因為底面玻璃折射會影響抑菌圈測量的準確度。記錄測量結果后進行效價計算。8.討論試驗中，往往會出現(xiàn)異常情況，使得試驗結果與預期出現(xiàn)很大差異。因此抗生素試驗的每一步都需要仔細謹慎，嚴格按照操作規(guī)范，才可以得到準確的檢測結果。準確測定抗生素效價，對評價抗生素的治療效果，指導臨床應用都有著重要意義。操作流程示意圖：根據(jù)品種，查表確定所用緩沖溶液、培養(yǎng)基、菌懸液種類稱取標準品、樣品，并按規(guī)定稀釋培養(yǎng)基、緩沖溶液的配制菌懸液、雙碟的制備續(xù)前頁放置牛津杯滴加抗生素溶液，加陶瓦圓蓋雙碟中菌株的培養(yǎng)抑菌圈的測量記錄數(shù)值于表中計算式中：P為供試品效價（相當于標示量或估計效價的百分數(shù)）

S2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

T2為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

S1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

T2為供試品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

I為高、低濃度之比的對數(shù)值，2：1時，I=0.301；4：1時，I=0.602二劑量法計算公式：三劑量法的計算公式：式中：P為供試品效價（相當于標示量或估計效價的百分數(shù)）

S3為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

T3為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；S2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

T2為供試品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

S1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

T1為供試品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和；

I為高、低濃度之比的對數(shù)值，1：0.8時，I=0.0969考題根據(jù)參考人員回憶整理的內容。微生物組：一、問答題：1、管碟法中影響抑菌圈邊緣清晰的因素有哪些？答：管碟法系利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，比較標準品與供試品兩者對接種的試驗菌產生抑菌圈的大小，以測定供試品效價的一種方法。（1）鋼管的清潔度（2）檢定用菌種的生長情況（3）菌懸液的濃度

2、HPLC哪些色譜條件可以改變，哪些不可改變？答：各品種項下規(guī)定的色譜條件，除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不可改變外，其它條件如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成成分的比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等均可改變。

3、生物檢定的兩種方法管碟法和濁度法各有什么優(yōu)缺點？答：管碟法具有靈敏度高，能直接顯示抗生素的抗菌效價的特點；由于試驗過程長，操作步驟多，影響試驗結果的因素較多，需要從各個環(huán)節(jié)嚴格控制試驗條件減少誤差。濁度法具有快速、靈敏度高、易操作、無擴散因素影響等優(yōu)點；但這一方法往往因供試品中含有雜質，影響細菌生長，并且不適用于有色或混濁的供試品。（關于抗生素的效價測定方法的介紹請見附頁。）4、pH測定的步驟和注意事項有哪些？答：操作步驟：1、校正1.1將PH電極與儀器輸入相連接。1.2將電源插頭與POWER連接，并接通電源。1.3將電極浸入PH=4.01校正液中，按pH/mV鍵直至顯示出pH測量方式。顯示屏閃爍顯示校正液的值，等達到穩(wěn)定狀態(tài)時必須調整至與標示值一致。1.4取出電極用測pH的水洗凈，用濾紙吸干。1.5將電極浸入PH=7.00校正液中，顯示值應與標示值一致，則表示電極校正完成。1.6如果顯示值與標示值不一致，則更換較正液重復1.3-1.5，如果仍顯示不正確，則表示電極有故障，需更換電極。1.7取出電極放入裝RO水的燒杯中待用。1.8將電極浸入待測液中，儀器會自動進行測量，待顯示屏中穩(wěn)定顯示“S”時，顯示的數(shù)值就是待測液的PH值。1.9測試完畢，把電極和溫度計用RO水洗凈，并放入RO水中保護。5、分析天平稱量前的準備工作有哪些？答：檢查天平的內外部清潔情況，核實最大載重量，核實是否已校驗，檢查天平是否水平及零點無異常時即可進行稱量；做好記錄。二、分析題：生物檢定方面的三、計算題：1、已知對照品溶液m1g，m2g，溶于50ml容量瓶中，20μl進樣，峰面積分別為A1、A2；另取供試品m1’g，m2’g，溶于100ml，20μl進樣，峰面積分別為A1’、A2’。已知對照品的含量P%，供試品水分為2.2%，求供試品含量。

2、求溶出度的題四、判斷題：有效數(shù)字修約271.3℃（熔點）271.5℃263.7℃（熔點）263.5℃應該明確“有效數(shù)字”的概念：有效數(shù)字是指實際上能測量到的數(shù)字。熔點測定法中規(guī)定所用的溫度計讀數(shù)應該有0.5℃。這樣此題的依據(jù)也就找到了。2.831×3.2在乘除運算中，應以參加運算的各數(shù)據(jù)中相對誤差最大（即有效數(shù)字位數(shù)最少）的數(shù)據(jù)為標準，決定結果（積或商）的有效位數(shù)。中間算式中或多保留一位。遇到首位數(shù)是8或9時，可多算一位有效數(shù)字。五、填空題：1、《藥品管理法》的實施時間為（1984年9月20日頒布，1985年7月1日實施；2001年修正版本，2001年2月28日頒布，2001年12月1日實施）

2、《藥品管理法》第三十二條規(guī)定藥品必須符合國家藥品標準