植物線粒體電子傳遞鏈產(chǎn)生活性氧ros的機(jī)制

通常，植物細(xì)胞內(nèi)的生物氧（ros）的產(chǎn)生和消除是平衡的。然而，當(dāng)植物體受到外部（包括生物和非生物壓力，如極端溫度、水分脅迫、細(xì)菌入侵等）的影響時(shí)，ros的產(chǎn)生和代謝會(huì)失去平衡，導(dǎo)致氧氣流失。在發(fā)生氧脅迫時(shí),會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS,如超氧陰離子自由基(O??22-?),過(guò)氧化氫(H2O2),羥自由基(HO·),一氧化氮(NO·)等。ROS能與細(xì)胞內(nèi)各種生物大分子起反應(yīng),導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)的傷害和脂質(zhì)的過(guò)氧化。對(duì)于需氧生物來(lái)說(shuō),ROS是代謝過(guò)程中不可避免的產(chǎn)物。植物細(xì)胞中產(chǎn)生ROS的部位有葉綠體,線粒體和過(guò)氧化物體等,其中線粒體是產(chǎn)生ROS的主要部位。ROS即可以通過(guò)電子傳遞過(guò)程產(chǎn)生,如線粒體和葉綠體的電子傳遞;也可以通過(guò)代謝產(chǎn)生,如脂肪酸的β-氧化。研究表明,在植物細(xì)胞內(nèi)ROS不僅與逆境脅迫、葉片和種子衰老,以及種子的脫水敏感性有關(guān),而且可以作為信號(hào)分子引起植物和細(xì)胞內(nèi)的分子、生化和生理反應(yīng)。目前,人們普遍認(rèn)為,ROS與植物細(xì)胞的程序性死亡(programmedcelldeath,PCD)有關(guān);在植物的PCD過(guò)程中ROS可能起兩方面的作用,一是作為信號(hào)分子啟動(dòng)引起細(xì)胞死亡的反應(yīng),二是在植物細(xì)胞的死亡過(guò)程中起直接的作用。1遞鏈對(duì)ros活性的影響線粒體的主要功能是為細(xì)胞提供能量,以及為其他大分子的生物合成提供碳骨架。植物組織中耗費(fèi)的氧,約有1%用于ROS的產(chǎn)生。在正常情況下,哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),O??22-?和H2O2的濃度分別為10-12～10-11mol/L和10-9～10-7mol/L,處于很低的水平。關(guān)于植物細(xì)胞內(nèi)ROS濃度的報(bào)道很少,Puntarulo等的研究表明,在正常條件下,大豆(Glycinemax)胚軸中H2O2的濃度為5μmol/L;而當(dāng)用氨基三唑(aminotriazole)抑制過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)的活性時(shí),H2O2的濃度可達(dá)到50μmol/L,比哺乳動(dòng)物的水平高得多;但這種現(xiàn)象是否普遍,還有待進(jìn)一步證實(shí)。植物線粒體的電子傳遞鏈(electrontransportchain,ETC)包括四種復(fù)合物(complex,C),即NADH脫氫酶(NADHdehydrogenase,CI),琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase,CⅡ),輔酶Q-細(xì)胞色素bc1還原酶(ubiquinol-cytochromebc1,CⅢ),細(xì)胞色素c氧化酶(cytochromecoxidase,CⅣ),它們具有與動(dòng)物線粒體相似的電子傳遞特性(圖1)。但是,植物的ETC還包括五種在哺乳動(dòng)物線粒體中不存在的酶:1種交替氧化酶(alternativeoxidase,AOX)和4種NAD(P)H脫氫酶(圖1),這4種脫氫酶具有與黃素蛋白(flavoproteins)非常相似的特性,因此也是ROS產(chǎn)生的潛在位點(diǎn)。除了上述4種復(fù)合物外,在植物線粒體的內(nèi)膜上還存在4種NAD(P)H脫氫酶,外部魚(yú)藤酮不敏感的NADH脫氫酶(externalrotenone-insensitiveNADHdehydrogenase,NDex(NADH)),外部魚(yú)藤酮不敏感的NADPH脫氫酶(externalrotenone-insensitiveNADPHdehydrogenase,NDex(NADPH)),內(nèi)部魚(yú)藤酮不敏感的NADH脫氫酶(internalrotenone-insensitiveNADHdehydrogenase,NDin(NADH)),內(nèi)部魚(yú)藤酮不敏感的NADPH脫氫酶(internalrotenone-insensitiveNADPHdehydrogenase,NDin(NADPH));其中,NDin(NADH)和NDin(NADPH)位于線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè),NDex(NADH)和NDex(NADPH)位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)。它們分別氧化線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的NAD(P)H,產(chǎn)生e-進(jìn)入ETC(圖1)。在這4種酶中,只有NDin(NADH)的活性是不依賴Ca2+的,其它3種酶都需要Ca2+活化。因?yàn)榫哂幸蕾嘋a2+的特性,所以,只有在脅迫的條件下才可能被激活。關(guān)于這4種酶的定位、理化特性、抑制劑及影響因素,在的綜述中已有較詳盡的闡述;但是,這些酶活性的調(diào)節(jié)因子仍需要進(jìn)一步的研究。2細(xì)胞不受傷害低濃度的ROS能提高植物細(xì)胞的抗氧化防御機(jī)制,從而清除活性氧,使細(xì)胞不受傷害。但ROS可以與蛋白質(zhì)、脂類和DNA作用,引起酶活性降低,膜透性和突變?cè)龃?。在植物線粒體中,存在幾種減少ROS產(chǎn)生的可能機(jī)制(表1)。2.1u3000eq基因的合成因?yàn)镺2是與還原型的電子傳遞組分起反應(yīng),所以,減少ROS產(chǎn)生的途徑之一就是阻止ETC的過(guò)量還原。避免ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是減少其潛在傷害效應(yīng)的第一道防線(表1)。長(zhǎng)期以來(lái),AOX被看作是一種“溢出機(jī)制(overflowmechanism)”,以吸收細(xì)胞色素鏈飽和后剩下的電子。有實(shí)驗(yàn)證明,在丙酮酸存在時(shí),AOX能與未飽和的細(xì)胞色素鏈競(jìng)爭(zhēng)電子。用氯霉素處理細(xì)胞和組織引起CⅠ～Ⅳ的活性降低時(shí),AOX和NDex(NADH)的活性就會(huì)比對(duì)照增加數(shù)倍。Purvis和Shewfelt最早提出AOX在ETC中起減少ROS產(chǎn)生的作用。Wagner報(bào)道,在矮牽牛(Petuniahybrida)的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,H2O2的加入可以誘導(dǎo)AOX的合成。Maxwell等的研究又表明,在AOX過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞中,ROS的量?jī)H為對(duì)照細(xì)胞的一半;相反,在通過(guò)反義技術(shù)減少AOX表達(dá)的細(xì)胞中,其ROS的量比對(duì)照細(xì)胞多5倍。所以,作為1條電子傳遞支路,AOX的存在在一定程度上限制了ROS的產(chǎn)生。2.2其他植物sod的分布ROS一旦生成,就必須被有效地清除,使其傷害達(dá)到最小。這樣,ROS的清除就構(gòu)成了減少其有害作用的第二道防線(表1,圖2)。O??22-?在SOD催化下轉(zhuǎn)變成O2和H2O2。H2O2又在CAT的催化下轉(zhuǎn)變成O2和H2O。在植物體內(nèi),有3種形式的SOD,Fe-SOD,Mn-SOD和Cu-Zn-SOD;其中,Fe-SOD位于葉綠體,Mn-SOD(KCN不敏感的)位于線粒體和過(guò)氧化物體,而Cu-Zn-SOD在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間隙都有分布。當(dāng)植物線粒體的Mn-SOD基因在Mn-SOD缺乏的酵母菌株(yeaststrain)中表達(dá)時(shí),細(xì)胞重新獲得了對(duì)氧化脅迫的抵抗力。動(dòng)物線粒體中有CAT;但在植物線粒體內(nèi)是否有CAT還不清楚。2.3單脫氫抗壞血酸還原酶和谷胱甘肽還原酶在葉綠體中,抗壞血酸(ascorbicacid,AsA)/谷胱甘肽(glutathione)循環(huán)是清除ROS的主要系統(tǒng),它包括抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbateperoxidase,APX),脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbatereductase,MDAR),單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbatereductase,MDAR)和谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase,GR),以及2種小分子量的物質(zhì)(AsA和谷胱甘肽)。在豌豆(Pisumsatium)葉的線粒體中,已經(jīng)有完整的抗壞血酸/谷胱甘肽循環(huán)的報(bào)道;但還有待于進(jìn)一步證實(shí)。在豌豆葉的線粒體中谷胱甘肽和AsA的濃度約分別為6、24nmol·mg-1蛋白。植物細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)幾條途徑合成AsA,但主要途徑的最后步驟都包括1種線粒體酶,L-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-γ-lactonedehydrogenase)。2.4gpx有利于ros損傷的修復(fù)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxudase,GPX)構(gòu)成了利用谷胱甘肽來(lái)減少H2O2、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物和其他氫過(guò)氧化物的另一個(gè)酶家族。在哺乳動(dòng)物的線粒體中,GPX是清除H2O2的主要酶。盡管在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種GPX的類似物,而且其中1種已經(jīng)被純化和鑒定,但在植物線粒體中還未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。在GPX的超家族中,有1種磷脂氫過(guò)氧化物谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(phospholipid-hydroperoxideglutathioneperoxidase),它能夠直接作用于脂質(zhì)氫過(guò)氧化物,而不是作用于釋放的過(guò)氧羥脂肪酸(hydroperoxyfattyacid)。因此,GPX有利于ROS損傷的修復(fù),是防御ROS傷害的第三道防線(表1)。在線粒體基質(zhì)中,氧化型的谷胱甘肽(GSSG)再生成還原型的谷胱甘肽(GSH)可以通過(guò)抗壞血酸/谷胱甘肽循環(huán),或者通過(guò)GPX產(chǎn)生,但都需要NADPH專一的谷胱甘肽還原酶催化,在ROS的產(chǎn)生和谷胱甘肽氧化水平都較高的代謝條件下,GPX可能是主要消耗NADPH的酶。2.5trx-s-s硫氧還原酶硫氧還蛋白(thioredoxin)是1個(gè)小分子量的蛋白,約為12～14kD,其活性中心具有兩個(gè)半胱氨酸殘基,它能形成氧化形式的二硫化物(Trx-(S-S))。硫氧還蛋白還原酶(thioredoxinreductase)利用NADPH將Trx-(S-S)轉(zhuǎn)化成還原型的二硫化物(Trx-(SH2)),與硫氧還蛋白一起作用調(diào)節(jié)酶的活性并清除氫過(guò)氧化物(hydroperoxide)和H2O2。在植物線粒體中,已經(jīng)鑒定了2種硫氧還蛋白和1種硫氧還蛋白還原酶。但是,在植物線粒體中這種酶系統(tǒng)的功能目前還不清楚,可能類似于酵母和哺乳動(dòng)物線粒體中的酶系統(tǒng),與氧化脅迫的保護(hù)作用有關(guān)。3ros對(duì)細(xì)胞的作用ROS除了導(dǎo)致細(xì)胞的傷害以外,還可以在植物細(xì)胞中作為一種普遍存在的信號(hào)分子起作用。ROS也是脅迫反應(yīng)的1種主要成分,它的水平既取決于外界的脅迫劑量(stressdose)(脅迫強(qiáng)度×脅迫時(shí)間),也決定于細(xì)胞的反應(yīng)類型;在低濃度的條件下,能引起細(xì)胞的防御和適應(yīng)反應(yīng);而在高濃度的條件下則引起細(xì)胞死亡。3.1光氧化脅迫對(duì)葉片基因型誘導(dǎo)的影響隨著CAT作為1種水楊酸(salicylicacid,SA)的結(jié)合蛋白被確認(rèn),以及在致病相關(guān)的(pathogenesis-related,PR-1)基因的誘導(dǎo)中H2O2位于SA的下游;這些實(shí)驗(yàn)使人們注意到H2O2在植物防御反應(yīng)中的信號(hào)作用。一系列實(shí)驗(yàn)表明,在植物防御基因例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase)基因(GST)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶基因(GPx)的誘導(dǎo)中,H2O2確實(shí)是1種可擴(kuò)散的信號(hào)。在玉米(Zeamays)胚和葉片中,由損傷導(dǎo)致的編碼CAT基因的表達(dá)是由H2O2引起的。在用無(wú)毒病原菌接種過(guò)的大豆(Glycinemax)細(xì)胞和未被感染的細(xì)胞之間放置CA陷阱(CATtrap),可以阻斷來(lái)源于被感染細(xì)胞的可擴(kuò)散的信號(hào),而且這種CAT陷阱對(duì)防御基因的誘導(dǎo)是必須的。經(jīng)UV-B處理過(guò)的煙草(Nicotianatabacum)葉片,其PR-1蛋白的誘導(dǎo)也需要ROS的積累。由于葡萄糖氧化酶的組成性過(guò)量表達(dá),或者過(guò)氧化物體中CAT活性受抑制而具有較高H2O2水平的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病原菌具有較高的抗性、積累較多的SA,以及表達(dá)PR基因和蛋白。在CAT缺乏的煙草植株葉片中,H2O2的積累不僅能局部而且系統(tǒng)地誘導(dǎo)防御蛋白(GPx,PR-1)的產(chǎn)生。將擬南芥(Arabidopsisthaliana)植株部分地暴露在過(guò)剩的光照中,可導(dǎo)致未暴露葉片對(duì)光氧化脅迫(photo-oxidativestress)的系統(tǒng)適應(yīng)。這種適應(yīng)與APX基因(Apx2)的表達(dá)有關(guān),并認(rèn)為是由H2O2介導(dǎo)的;因?yàn)锳Px2的誘導(dǎo)對(duì)CAT特別敏感。用H2O2預(yù)處理的擬南芥葉片也表現(xiàn)出對(duì)過(guò)剩的光照有耐性。在萌發(fā)的水稻(Oryzasativa)胚中,H2O2可以誘導(dǎo)編碼APX的基因表達(dá)。Orozco-Cárdenas等研究表明,由損傷引起的H2O2積累可以作為第二信使誘導(dǎo)包括蛋白酶抑制劑(proteinaseinhibitor)和多酚氧化酶(polyphenoloxidase)在內(nèi)的一亞組防御基因的表達(dá)。在“交叉耐性(cross-tolerance)”中,H2O2也可以作為一種信號(hào)分子。例如,在亞致死劑量(sublethaldose)的臭氧或UV中暴露以后,增強(qiáng)了對(duì)致病病原菌感染的耐性;熱脅迫處理誘導(dǎo)對(duì)隨后病原菌的抗性。在防御反應(yīng)中,H2O2被普遍認(rèn)為是一種信號(hào)分子,O??22-?(或者其衍生物)也可能起這種作用。大豆細(xì)胞對(duì)病原菌或者誘導(dǎo)物(elicitor)反應(yīng)產(chǎn)生植物抗毒素(phytoalexin)被DPI或SOD抑制,但不受CAT的影響。同樣,在擬南芥?zhèn)Υ碳さ目共》磻?yīng)(lesion-simulatingdiseaseresistanceresponse)的突變體(lsdl)中,O??22-?是一種必需的因子,以及足夠地誘導(dǎo)傷害的形成和PR-1mRNA的積累,而H2O2則不能。此外,用產(chǎn)生O??22-?的洋地黃皂甙(digotonin)或黃嘌呤氧化酶(xanthineoxidase)處理后,1個(gè)編碼伸展蛋白(extension)的番茄(Lycopersiconesculentum)多基因家族成員在轉(zhuǎn)錄水平被誘導(dǎo);但H2O2處理則不能誘導(dǎo)。因此,O??22-?可能在防御反應(yīng)中作為信號(hào)分子起作用,不需要H2O2。相反,在水稻中百葉枯(paraquat)處理通過(guò)H2O2(被CAT或者APX的抑制作用促進(jìn))而不是O??22-?(被SOD抑制劑減少)誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)APX基因。3.2細(xì)胞死亡反應(yīng)在植物中,細(xì)胞的死亡有兩種方式:程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)和壞死(necrosis)。PCD是受遺傳控制的;具有動(dòng)物細(xì)胞中細(xì)胞凋亡(apoptoticcelldeath)的特征,例如細(xì)胞皺縮,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核濃縮,異染色質(zhì)增加,細(xì)胞質(zhì)空泡化,以及DNA片段化(DNAfragmentation)等。而壞死是由嚴(yán)重且持續(xù)的傷害所引起的,被認(rèn)為不受遺傳控制。PCD和壞死也可能是由同一ROS信號(hào)起始的相同過(guò)程的兩種不同結(jié)果。在大豆細(xì)胞的培養(yǎng)物中,一個(gè)短的H2O2脈沖就足夠活化過(guò)敏性的細(xì)胞死亡(hypersensitivecelldeath)機(jī)制。在擬南芥懸浮培養(yǎng)物中,外源的H2O2(>5mmol/L)能起始1條活性細(xì)胞的死亡途徑(需要DNA和蛋白質(zhì)的重新合成)。在具有較低的H2O2清除能力的轉(zhuǎn)基因植物,或者在其他過(guò)量產(chǎn)生形成H2O2的酶的植物中,自發(fā)地出現(xiàn)細(xì)胞死亡,或者容易地被脅迫誘導(dǎo)。CAT缺乏的煙草植株短暫暴露到使H2O2的穩(wěn)態(tài)紊亂的條件(高光強(qiáng))下,足夠活化1個(gè)類似于不相容性植物-病原菌相互作用過(guò)程中觀察到的PCD程序。過(guò)敏性反應(yīng)(hypersensitiveresponse,HR)是一種典型的不相容性的植物-病原菌相互作用。在HR過(guò)程中,在病原菌侵襲的位點(diǎn)氧化突發(fā)(oxidativeburst)與細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)一致。這種局部的細(xì)胞死亡限制了侵染病原菌的擴(kuò)散。然而,在HR過(guò)程中,抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)可能有助于AOS的產(chǎn)生。在通過(guò)真菌誘導(dǎo)物處理的HR的煙草細(xì)胞中,過(guò)氧化氫酶Cat1和Cat2的mRNA和蛋白質(zhì)水平降低,以及酶活性被抑制;這與H2O2的大量積累相平衡。同樣,病毒誘導(dǎo)的類HR細(xì)胞死亡伴隨著細(xì)胞質(zhì)Apx表達(dá)的抑制。這種抑制可能有助于H2O2的積累和細(xì)胞死亡程序的活化。在擬南芥lsd1突變體中,是O??22-?而不是H2O2起始了1種不受控制的細(xì)胞死亡表型,這就為O??22-?在植物細(xì)胞死亡中的作用提供了遺傳證據(jù)。在長(zhǎng)日照下生長(zhǎng)的lsd1植株自發(fā)地在葉片上形成壞死損傷,以及不能阻止細(xì)胞死亡的擴(kuò)散。在細(xì)胞死亡擴(kuò)散區(qū)域的前沿,O??22-?顯著地積累。在自由基誘導(dǎo)的擬南芥細(xì)胞死亡突變體(rcd1)中,是臭氧和O??22-?,而不是H2O2,誘導(dǎo)細(xì)胞的H2O2積累和短暫的擴(kuò)散損傷,細(xì)胞的O??22-?積累取決于乙烯。外源乙烯增加依賴于O??22-?的細(xì)胞死亡,而乙烯感受的損傷阻斷O??22-?的積累和擴(kuò)散傷害。在大麥糊粉層中,由植物激素赤霉素導(dǎo)致的PCD也是由H2O2介導(dǎo)的,這就暗示,H2O2不僅介導(dǎo)病原菌入侵引起的PCD,而且在發(fā)育的PCD中起作用。3.3通過(guò)h2基因誘導(dǎo)的煙草基因表達(dá)在擬南芥和大豆HR過(guò)程中,由H2O2誘導(dǎo)的PCD需要轉(zhuǎn)錄和翻譯。一些研究表明在防御反應(yīng)中H2O2調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在大豆中,H2O2誘導(dǎo)防御相關(guān)基因GST和GPX的表達(dá)。在擬南芥懸浮培養(yǎng)物中,H2O2誘導(dǎo)GST和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)的表達(dá)。在各種脅迫包括氧化脅迫后,GST構(gòu)成了細(xì)胞解毒作用過(guò)程中涉及的酶家族。GPX在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中清除H2O2,PAL涉及防御相關(guān)化合物的合成。編碼1種蛋白體(proteasome)亞基的煙草基因也被H2O2誘導(dǎo)。蛋白體與蛋白質(zhì)的降解有關(guān),是HR細(xì)胞死亡過(guò)程中的共同特征。H2O2能誘導(dǎo)與NADPH氧化酶合成有關(guān)的基因表達(dá),誘導(dǎo)萌發(fā)的水稻胚和擬南芥葉片中編碼APX的基因表達(dá)。在玉米胚和葉片中,損傷通過(guò)H2O2誘導(dǎo)編碼CAT的基因表達(dá)。在非生物脅迫條件下,H2O2也參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。例如,UV-B誘導(dǎo)的基因表達(dá)也通過(guò)H2O2介導(dǎo);在抗氧化劑存在時(shí),暴露到UV-B中的擬南芥植株導(dǎo)致由UV誘導(dǎo)的基因PDF1.2被減量調(diào)節(jié)(down-regulation)。已經(jīng)證明H2O2誘導(dǎo)編碼過(guò)氧化物體生物發(fā)生(peroxisomebiogenesis)所需要的蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。過(guò)氧化物體是ROS、抗氧化劑和NO的重要來(lái)源,因此,是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。有趣的是,編碼信號(hào)蛋白(signalingprotein)例如轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor)、蛋白激酶(proteinkinase)和蛋白磷酸酶(proteinphosphatase)的基因也被H2O2增量調(diào)節(jié)(up-regulation),這些基因類似于由其他脅迫例如萎蔫、UV輻射和細(xì)胞誘導(dǎo)物處理誘導(dǎo)的基因;而編碼半胱氨酸蛋白酶(cysteineprotease)的基因則被H2O2減量調(diào)節(jié)。1種煙草蛋白磷酸酶2C(tobaccoproteinphosphatase2C,NtPP2C1)基因被H2O2和熱休克(heatshock)減量調(diào)節(jié),被干旱脅迫增量調(diào)節(jié)。4no與谷胱甘肽植物能合成和釋放氣體分子一氧化氮(nitrogenoxide,NO)。早期的研究提出,NO調(diào)控根的生長(zhǎng),以及作為一種內(nèi)源的成熟和衰老因子起作用。在動(dòng)物中,NO主要是通過(guò)一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)被合成。在植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了NOS的活性,哺乳動(dòng)物NOS的抑制劑抑制植物中NO的產(chǎn)生。此外,由哺乳動(dòng)物NOS產(chǎn)生的抗體能與植物蛋白起交叉反應(yīng)。已經(jīng)從豌豆過(guò)氧化物體中純化了1種NOS,以及獲得了1條豌豆NOS的部分cDNA克隆。NO的其他來(lái)源包括硝酸還原酶(nitratereductase);也可能有其他的非酶促途徑,例如亞硝酸/抗壞血酸相互作用,或者通過(guò)類胡蘿卜素由光調(diào)節(jié)的NO2轉(zhuǎn)化為NO。NO本身是1種自由基(NO·),能夠與O??22-?作用形成高度活化的過(guò)氧化亞硝酸陰離子(peroxynitriteanion,ONOO-),隨后由過(guò)氧化亞硝酸誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)。在哺乳動(dòng)物中,NO與谷胱甘肽反應(yīng)生成S-亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione,GSNO),GSNO能夠作為NO的釋放源(systemicsource);植物具有類似的情況。H2O2與NO通常不是單獨(dú)起作用,而是與其他信號(hào)分子一道作用。這些信號(hào)分子可能組成性的存在,或者在脅迫過(guò)程中增加濃度/活性(例如通過(guò)改變細(xì)胞的敏感性),例如ABA、茉莉酸、乙烯和SA(圖3)。NO的細(xì)胞內(nèi)靶子還不清楚。NO可能通過(guò)亞硝基化(nitrosylation)直接與蛋白質(zhì)作用。已經(jīng)證明NO抑制順烏頭酸酶(aconitase)的活性。NO也抑制CAT和APX活性。在植物-病原菌相互作用過(guò)程中,NO激活防御相關(guān)基因PAL1、PR-1和GST的表達(dá)。另1個(gè)NO的潛在靶基因是病原菌誘導(dǎo)的過(guò)氧化物酶(pathogen-inducedoxygenase,PIOX)基因,該基因在植物防御反應(yīng)過(guò)程中涉及氧化還原信號(hào)(圖3)。已經(jīng)證明,在煙草中NO信號(hào)需要環(huán)鳥(niǎo)苷一磷酸(cyclicguanosinemonophosphate,cGMP)的合成。NO處理誘導(dǎo)cGMP含量的瞬時(shí)增加,cGMP合成的抑制劑通過(guò)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(guanyl