免疫學(xué)常用實驗方法第1頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Ag-Ab

reation:ELISA,

Immunohistochemistry,

FACS,

Western

blot,Hybridoma

&

monoclonal

antibodyCell

function:3H－TdRproliferation

MTTCFSE第2頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Cytotoxicity51CrAnimal

experiment非共價鍵結(jié)合I.Antigen-Antibody

Reaction抗體的互補決定區(qū)(CDRs)第3頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一抗原決定簇(antigenic

determinant)又稱表位(epitope)非共價鍵結(jié)合CDR

1CDR

2CDR

3CDR

1CDR

2CDR

3CDR:

Complementarity

Determining

RegionFR:

Framework

RegionFR1CDR1

FR2CDR2FR3CDR3FR4H第4頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一LComplementarity-determining

regions

(CDRs):AntigenicDeterminant第5頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Specificity

特異性Features

of

Ag-Ab

Reaction第6頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Reversibility可逆性第7頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Ag+Ab→Ag·Ab解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。在一定條件下(如低pH、高濃度鹽等)可以解離。Ratio最適比例第8頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Sensitivity敏感性第9頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一化學(xué)比色法：

mg/ml酶反應(yīng)測定法：5-10μg/ml(免疫測定中凝膠擴散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿)標記的免疫測定法：ng/ml

水平(例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg，其敏感度可達0.1ng/ml)ELISA------酶聯(lián)免疫吸附試驗Immunohistochemistry--------免疫組織化學(xué)FACS------流式細胞術(shù)Western

Blotting-------免疫印跡技術(shù)第10頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Often

used

methods1.ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗

Enzyme

Linked

ImmunoSorbentAssay)RIA

(radioimmunoassay,

Berson&Yalow，1960)第11頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一IRMA(immunoradiovelric

assay,

Miles&Hiles,1968)E(L)I(S)A

(Engvall&Perlmann,

van

Weemen

andSchuurs

,

1971)Estimates

of

the

number

of

articles

published

per

5

-

year

period

from

1960

to

2005Figure.

Estimates

of

the

number

of

articles

published

per

5-year

period

from

1960

to

2005.The

search

was

done

in

February

2005

in

PubMed/National

Library

of

Medicine,

NIH,

with

the

search

terms:

enzyme-immunoassay,

enzyme-linked

immunos(EIA/ELISA

combined),

and

RIA.

(Ordinate),

number

of

articles

in

which

the

keywords

are

quoted.

(Abscissa),

5-year

periods

from

19combined

EIA/ELISA;

,

RIA.

[Note:

I

do

not

pretend

that

the

numbers

in

this

figure

are

precise;

the

trends,

howeveL

e

q

u

in

,

R

.

M

.

C

lin

C

h

e

m

2

005;51

:2415-2

418第C1o2p頁yr，ig共ht62?頁20，052A0m2e2r年ic，an5月As2s0o日ci，at1i8o點n

f9o分r

C，li星ni期ca一l

ChemistryELISA?基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化抗原或抗體的酶標記用途：目標蛋白的定性或定量分析三個必要試劑：固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）;酶標記的抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。第13頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一ELISA基本的實驗過程

a.包被b.抗原抗體反應(yīng)

c.酶促反應(yīng),顯色d.終止顯色，讀取數(shù)據(jù)。對照和標準曲線陽性對照陰性對照定量測定：標準品制作標準曲線待測樣品的合理稀釋第14頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一?不同類型的檢測方法第15頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一第16頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一2.Immunohistochemistry(免疫組化)原理：抗原抗體反應(yīng)，抗體標記技術(shù)（熒光、酶）用途：組織或細胞內(nèi)抗原的定性和定位流程：第17頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Zhao,

X.

et

al.Cancer

Res

2007

;67

:4443

-4450Figure

3

.

mTNF

induces

infiltration

of

innate

immune

cells

and

angiostin

tumors

from

TNFR1–/–

but

not

TNFR1–/–/R2–/–

mice.

A

to

F,

TNFR1–/mice

or

TNFR1–/–/R2–/–

mice

were

injected

s.c.

with

5

x

106

of

J-mTNF10

cells.

Tendays

after

tumor

cell

challenge,

tissue

sections

of

the

injection

site

were

stained

forMac-1+

(A

and

B),

Gr-1+

(C

and

D),

and

CD31+

(E

and

F)

cells

asindicated.

G

and

H,

for

confocal

microscopy

analysis,

tissue

sections

were

stainwith

Cy3-labeled

anti-CD31

for

blood

vessel

endothelial

cells

(green)

and

theVasoTACS

in

situ

kit

to

detect

apoptosis

(red).

Arrows,

apoptotic

endothecells

in

the

tumor.第C1o8py頁rig，ht

?共20076A2me頁ric，an

A2ss0o2ci2at年ion，for5C月ance2r0Re日sea，rch18點9分，星期一成敗的關(guān)鍵因素： 組織的固定、包埋抗體（特異性、濃度、孵育溫度和時間）非特異性抗原的封閉內(nèi)源性酶或自發(fā)熒光的消減顯色第19頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一思考：為什么有的抗體能用于冰凍切片卻不能用于石蠟切片？3.Flow

Cytometric

analysis(流式細胞術(shù))FACS:

(Fluorescence-Activated

Cell

Sorter)BD

FACSVantage第20頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一BD-Calibur?測量對象大小 懸浮在溶液中的相互離散顆粒大小范圍：0.2μm-300

μm高等真核細胞類型酵母細胞類型細菌多細胞的聚集體，如胰島等。細胞核非生命顆粒染色體其它細胞器以及乳化微球等。第21頁共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一主要用途細胞表型分析胞內(nèi)細胞因子的檢測細胞周期和DNA倍體分析細胞分選第22頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一（1）多參數(shù)定量分析每一個細胞；第23頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一（2）細胞分選；高純度：99%以上；可分析小于1/10000比例的稀有細胞群、單細胞克隆等。(3）高通量（分析分選）．分析150，000個/秒分選100，000個/秒特點基本結(jié)構(gòu)第24頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一工作原理第25頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一1二色鏡23帶通濾波片光電倍增管細胞收集透鏡前向散射光激光束側(cè)向散射光，熒光第26頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一a.光信號收集分離，導(dǎo)向，各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。FSC

SSC

FL1FL2FL3對數(shù)

線性線性線性

對數(shù)脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換光信號電信號記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果第27頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一b.數(shù)據(jù)處理c.

細胞分選488

nm

laser+-Charged

PlatesSingle

cells

sortedinto

test

tubesFALS

SensorFluorescence

detector第28頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）顆粒度細胞大小第29頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一流式細胞儀數(shù)據(jù)分析非熒光信號直方圖分析第30頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一熒光信號點狀圖分析第31頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一設(shè)門分析可以通過設(shè)“門”(Gate)，分析、分選感興趣的細胞。第32頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一實驗對照的設(shè)計陰性對照：常用同型抗體對照陽性對照：單陽性對照（多色分析時用于儀器校正）抗體的選擇首選直標抗體熒光分子實驗標本的處理單細胞懸液的制備抗體濃度非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉第33頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一4.

Western

Blott第34頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一5.

Hybridoma

Technique

&

Monoclonal

Antibody

PreparationJerme，K?hler

and

Milstein

1984

Nobel

PrizeB

cellMyelomaSecrete

AbClonalA

clonal

cell

line

secreting

specific

Ab?第35頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一B

cellMyelomaFusionB

cellB

cell+BcellB

cell+MyelomaMyelomaMyeloma+Myelomaalive第36頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一A(氨基喋呤)DNAHGPRT+，

TK+H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶B

cell+Myeloma

Myeloma

Myeloma+MyelomaHGPRT-，

TK-HGPRT-，

TK-H,次黃嘌呤

T,胸腺嘧啶DieA

clonal

cell

line

secreting

specific

Ab---HybridomaHGPRT

次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine

guznine

phosphoribosyl

transferase)第37頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一TK胸腺嘧啶激酶(Thymidine

kinase)第38頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Preparing

mAbs

from

murine

ascitesPristane

(i.p.)Hybridoma

(i.p.)ascitesMonoclonal

antibody第39頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一ELISAII.

Assay

for

cell

function第40頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Proliferation:

T

cell,

tumor

cell,

…Cytotoxic

assay

:

T

cell,

NK

cell,

…Cell

ProliferationStimulators第41頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Nonspecific:Mitogen

:

LPS,

ConA,

PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:

CD3,

TCR,

CD28Specific:specific

antigen:破傷風(fēng)類毒素，PPD(純結(jié)核蛋白衍生物)MHC:同種異體細胞(MLR,混合淋巴細胞培養(yǎng))washStimulate第42頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一AssayAssay

for

T

cell

proliferation3H-TdR3H-TdRb.

MTTAssay

Mechanism:操作簡單，重復(fù)性差第43頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一c.

CFSEFigure

15

.67

Following

cell

proliferation

in

human

peripheral

blood

lymphocytes

using

the

CellTrace

CFSE

CellKit

C34554).

Human

peripheral

blood

lymphocytes

were

harvested

and

stained

with

CellTrace

CFSE

(carboxyfluor

diacetate,

succinimidyl

ester;

5(6)-CFDA,

SE)

on

Day

0.

A

portion

of

the

population

was

arrested

at

the

parentmitomycin

C

(red

peak).

The

remainder

of

the

sample

was

stimulated

with

phytohemagglutinin

and

allowed

to

proldays.

Solid

green

peaks

represent

successive

generations.第44頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一CELLproliferationAssay

for

T

cell

cytotoxicityTarget

cell51Cr

labeledTarget

cellCTLTarget

cellCr51

releaseAssayCTL51Cr

release第45頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Isolation

of

stem

cells密度梯度離心法單抗貼壁鋪展法免疫磁珠分選流式細胞分選法III.

Technology

involved

in

stem

cell

research第46頁共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Indentification

of

stem

cells顯微鏡技術(shù)：生長形態(tài)，核型人類骨髓干細胞第47頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一基因芯片：分析基因表達差異FACS：造血干細胞可鑒定如下marker—CD34，CD33，Sca-1，c-Kit體內(nèi)分化：胚胎干細胞在裸鼠體內(nèi)生長分化，形成包含三個胚層來源的良性畸胎瘤Culture

of

isolated

stem

cells以鼠胚胎干細胞培養(yǎng)為例：第48頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一1，飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)2，飼養(yǎng)層的制備3，小鼠胚胎干細胞分離培養(yǎng)1）內(nèi)細胞團的分離與培養(yǎng)2）ES樣細胞擴增）單細胞克隆建系）鑒定—MEF分離—絲裂霉素C處理或G

γ射線照射Differentiation

of

Stem

Cells懸浮培養(yǎng)法—不同的培養(yǎng)基及細胞因子第49頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一共培養(yǎng)—與不同的支持細胞共培養(yǎng)III.

Animal

experimentImmune

deficient

mice裸小鼠(nudemice)，無毛，先天性胸腺發(fā)育不良，T細胞功能缺失。第50頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一SCID：Severe

combinedimmune

deficiency嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠T、B淋巴細胞功能均缺失A

variety

of

knock-out

mice:μMT,

RAG1-/-,

RAG2-/-IFNγ-/-,

IL4R-/-

…第51頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Transgenic

mice:

GFP-transgenic

mice第52頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Generation

of

transgenic

mice第53頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Animal

experiments第54頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一第55頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一第56頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Isolate

lymphocytes

from

spleen

or

lymph

nodesIsolate

tumor

cells

from

tumor

tissue.第57頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Advanced

animal

experimentAdoptive

transfer:

T,

B,

sera…Bone

Marrow

ChimeraSkin

graft第58頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Thank

You!第59頁，共62頁，2022年，5月20日，18點9分，星期一Topics第60頁，共62頁，2022年，5月20