塔形標(biāo)準(zhǔn)化馬氏桿菌精細(xì)胞因發(fā)生與發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)觀察

動物精氣的形態(tài)結(jié)構(gòu)和發(fā)生過程是寄生蟲生物學(xué)的一項(xiàng)重要研究內(nèi)容，其結(jié)構(gòu)和運(yùn)動方式與精子形成過程密切相關(guān)。因此,軟體動物精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究歷來受到眾多學(xué)者的重視[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13]。目前,國內(nèi)外對腹足類軟體動物精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究較多[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],迄今為止,國內(nèi)的報(bào)道對原始腹足目動物精子發(fā)生的研究多側(cè)重于鮑科,而馬蹄螺科的研究未見報(bào)道。塔形馬蹄螺(TrochuspyramisBorn)隸屬于軟體動物門(Mullusca)、腹足綱(Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、原始腹足目(Archaegastropoda)、馬蹄螺科(Trochidae),是我國南方沿海的一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)貝類。關(guān)于該種類的生殖系統(tǒng)的形態(tài)解剖學(xué)和組織學(xué)、人工育苗的研究已經(jīng)開展,但有關(guān)其精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)尚未見報(bào)道。為此,筆者對塔形馬蹄螺精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察,旨在為腹足類的繁殖生物學(xué)及相關(guān)的基礎(chǔ)研究積累參考資料。1精子形態(tài)測量實(shí)驗(yàn)用塔形馬蹄螺樣采自海南省瓊海市長坡鎮(zhèn)的自然海區(qū),生活個體殼高3.74～5.86cm,殼寬4.20～5.68cm,殼體層4～5cm?；铙w帶回實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)行活體解剖,快速取出精巢,切成1mm3左右的小塊,用φ=2.5%戊二醛和φ=1%鋨酸雙固定,梯度酒精脫水,Epon812滲透包埋,LKB-Nova超薄切片機(jī)切片,醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,Joel-1010型透射電鏡下觀察、拍照。精子形態(tài)測量主要在電鏡照片上直接進(jìn)行,為了盡可能準(zhǔn)確,核的測量僅測定同時(shí)連接有頂體和中段的精子的核長和核寬;頂體、頂體凹陷和核前內(nèi)凹陷的測量僅測定頭部形態(tài)完整的精子;頂體寬、核寬分別指頂體基部和核基部的寬度。2結(jié)果2.1胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)和核型細(xì)胞體積最大,緊貼分布于精巢生殖小管的基膜部。細(xì)胞呈橢圓形,大小為6.3μm×4.1μm。細(xì)胞質(zhì)較少,含有少量圓形線粒體,其嵴稀少而短;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀少,呈小泡或小管狀;未見高爾基體等細(xì)胞器。但胞質(zhì)中有少許具膜的電子致密顆粒和溶酶體。細(xì)胞核大,位于細(xì)胞中央,大小為4.3μm×3.4μm,核膜清晰,核周腔明顯;核中異染色質(zhì)少,呈絮狀附于核膜內(nèi)側(cè)或不均勻散布在核質(zhì)中(圖版Ⅰ:1)。2.2電子致密顆粒及溶酶體由精原細(xì)胞生長轉(zhuǎn)化而來,細(xì)胞逐步脫離基膜。發(fā)育早期的初級精母細(xì)胞呈橢圓形,大小約為6.1μm×3.6μm。進(jìn)入減數(shù)分裂期的初級精母細(xì)胞大多呈卵圓形,約5.5μm×4.1μm。胞質(zhì)電子密度增高;線粒體數(shù)量增多,體積增大,嵴漸增多,分布在細(xì)胞的一側(cè);出現(xiàn)少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體、高爾基體,電子致密顆粒和溶酶體數(shù)量增多,溶酶體的直徑為0.36μm,內(nèi)容物較均一。在一些切面上可見到1～2個橫切的“9+2”軸絲結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核大小為4.7μm×4.0μm,偏向細(xì)胞一極,核周腔較大;核內(nèi)染色質(zhì)增多,凝集成不規(guī)則團(tuán)塊狀或條狀分布于其中(圖版Ⅰ:1,2,3)。2.3電子致密顆粒及胞核的觀察和測定初級精母細(xì)胞經(jīng)第1次成熟分裂(減數(shù)分裂)后形成染色體減半的次級精母細(xì)胞,這時(shí)期常見核分裂為二,而胞質(zhì)未見分開的現(xiàn)象,形成雙核細(xì)胞。細(xì)胞卵圓形,約4.5μm×3.7μm。胞質(zhì)電子密度高;線粒體體積較大,數(shù)量增多,一些線粒體發(fā)生融合而呈扁囊狀,一些線粒體仍呈初始的橢囊狀。電子致密顆粒和溶酶體逐漸集中于細(xì)胞的一端。“9+2”軸絲結(jié)構(gòu)明顯可見。胞核也近卵圓形,約3.2μm×2.7μm;局部核周腔清楚可見;核內(nèi)呈細(xì)顆粒狀的異染色質(zhì)進(jìn)一步凝聚成大團(tuán)塊,常染色質(zhì)區(qū)域變小(圖版Ⅰ:3,4)。2.4精細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)期精細(xì)胞是由次級精母細(xì)胞經(jīng)第2次成熟分裂產(chǎn)生,體積較小,精細(xì)胞逐漸分化成熟形成精子,其過程較為復(fù)雜,根據(jù)精細(xì)胞在變態(tài)期間胞質(zhì)與胞器的發(fā)育特征、核染色質(zhì)凝集程度及形態(tài)等的變化,將其分為5個時(shí)期。2.4.1含電子密度中等的均勻絮狀物細(xì)胞呈橢圓形,約3.9μm×2.7μm,可見到部分胞質(zhì)未完全分開的雙核細(xì)胞。在細(xì)胞核的一側(cè)開始出現(xiàn)前頂體囊的雛形,內(nèi)含電子密度中等的均勻絮狀物。胞質(zhì)中線粒體進(jìn)一步融合,并逐漸移向細(xì)胞一端,數(shù)量較次級精母細(xì)胞開始減少,但仍可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和核糖體散布,部分細(xì)胞質(zhì)開始往細(xì)胞的一側(cè)或核后遷移。在一些細(xì)胞內(nèi)可清楚地觀察到軸絲的橫切。核形仍與胞體一致,約2.5μm×1.9μm,核內(nèi)染色質(zhì)由較均勻彌散狀分布而逐漸聚合成致密的團(tuán)塊狀,相互連接,占據(jù)核內(nèi)大部分空間(圖版Ⅰ:5)。2.4.2軸絲及核型觀察細(xì)胞呈橢圓形,約3.3μm×2.2μm.前頂體囊遷移至核的前端并不斷增大,基本呈橢圓形。線粒體逐漸移至核的后端,開始融合為少數(shù)幾個,呈圓形或橢圓形,嵴增長;同時(shí),中心體也開始往核后端移至線粒體之間,可觀察到軸絲結(jié)構(gòu)。細(xì)胞質(zhì)繼續(xù)往核后退縮。核多為橢圓形,約2.0μm×1.6μm;核周腔不明顯;核內(nèi)染色質(zhì)顆粒逐漸變粗,并進(jìn)一步濃縮呈致密團(tuán)塊狀,電子致密度明顯增大,多數(shù)染色質(zhì)貼附于細(xì)胞核膜內(nèi)面分布,核內(nèi)有許多空泡狀的電子密度疏松的區(qū)域。核與前頂體囊相接觸面的中央略內(nèi)凹(圖版Ⅰ:6)。2.4.3核型材料的周腔觀察該期細(xì)胞形狀大小與Ⅱ期相似,約3.1μm×2.0μm。前頂體囊的內(nèi)含物繼續(xù)增多,逐漸聚集形成的形狀較為規(guī)則、圓形、外膜明顯,內(nèi)充滿均勻的高電子密度物質(zhì)前頂體,但含有一些中空的膜泡。線粒體移至核的一端后,線粒體進(jìn)一步融合,形成數(shù)量少、體積大的線粒體集合體。中心體移至核后窩線粒體之間,2個中心粒相互垂直排列,有1個橫切面為近圓形,另1個為短棒狀,可清楚觀察到軸絲結(jié)構(gòu)。大部分胞質(zhì)退至核后,前頂體和核周圍仍留有薄層胞質(zhì),胞質(zhì)中可見少量高爾基膜囊位于前頂體附近。核近卵圓形,約1.8μm×1.5μm。核周腔不明顯,核內(nèi)染色質(zhì)大部分融合成塊趨向高電子密度物質(zhì)均質(zhì)化,但局部仍可見電子密度疏松的區(qū)域。核前端中央逐漸內(nèi)凹,形成雛形核前窩,內(nèi)含密度較低的絮狀物質(zhì)(圖版Ⅰ:7,8)。2.4.4前頂體的電子密度細(xì)胞形態(tài)逐漸與精子相似,細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小,約2.8μm×1.5μm。前頂體繼續(xù)發(fā)育,外觀呈鈍圓錐形,內(nèi)部膜泡消失,內(nèi)含物大多呈均質(zhì);前頂體基部臨核面的中央內(nèi)凹,形成淺錐狀的頂體下腔,內(nèi)含電子密度與頂體類似的物質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)大量減少。精子中段形成,球狀線粒體堆積于核后,嵴長而密集;中心粒位于核后端的線粒體球之間。核形態(tài)趨向圓柱狀,大小為1.6μm×1.3μm;染色質(zhì)濃縮,大面積呈均質(zhì)化,電子密度進(jìn)一步加大;染色質(zhì)空缺的透明區(qū)呈不規(guī)則小囊泡狀,或稱核泡,其內(nèi)有的可見少許膜囊或顆粒物質(zhì)。核前窩較明顯。核后端與線粒體相接觸的地方內(nèi)凹形成植入窩(圖版Ⅰ:9)。2.4.5頂體凹陷形態(tài)與第Ⅳ期相比,本期主要變化是細(xì)胞核的延長。細(xì)胞大小為3.2μm×1.4μm,形態(tài)與精子基本相似。前頂體物質(zhì)密度增大,前頂體進(jìn)一步分化,呈馬蹄形扣在核端,并向內(nèi)凹陷,逐漸形成鈍圓錐形的頂體,此凹陷稱為頂體凹陷;核與頂體之間的腔隙,稱為頂體下腔,頂體腔內(nèi)充滿低電子密度物質(zhì);頂體下腔進(jìn)一步向前凹入,頂體形成。核延長呈長圓柱狀,為1.9μm×1.1μm。核內(nèi)染色質(zhì)高度濃縮,更均質(zhì)致密,有較少的核泡存在。核前窩凹陷加深,呈明顯淺“U”字形。核后窩處5個線粒體包圍中心粒;鞭毛已形成,由被原生質(zhì)膜包被的軸絲微管組成,軸絲為典型的“9+2”結(jié)構(gòu)。最后,精細(xì)胞丟棄多余的細(xì)胞質(zhì)而演變?yōu)槌墒斓木?圖版Ⅱ:1)。2.5成熟的精細(xì)結(jié)構(gòu)通過電鏡觀察塔形馬蹄螺精子為原生型精子,可分為頭部、中段和尾部(鞭毛)3部分。2.5.1頂體及核后窩的表現(xiàn)精子頭部長1.9μm,主要包括頂體、頂體下腔和細(xì)胞核3部分。頂體位于頭部最前端,其后與核相連,呈圓錐形,頂端較鈍;頂體長0.62μm,頂體基部寬0.67μm,頂體電子密度比較均勻;頂體的后端與核相接觸的部分向頂體內(nèi)凹陷,稱頂體下腔,呈“V”字型,長為0.46μm,占整個頂體長度的2/3以上。在核前方與頂體凹陷相對應(yīng)的區(qū)域向核內(nèi)凹陷形成的核前窩,呈淺“U”字型,長0.22μm,約占整個細(xì)胞核長的1/6;頂體下腔中有中等電子密度物質(zhì)存在,電子密度比頂體的電子密度低,較為疏松。細(xì)胞核呈圓桶狀,長1.19μm,中部核的寬約1.01μm,前端比后端略小,中間比后端略為突出,核后端凹陷形成的核后窩。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)致密,有一到幾處核泡存在,細(xì)胞核電子密度比較均勻,與頂體的電子密度差異不明顯(圖版Ⅱ:2,4)。2.5.2中心粒和精子的垂直分布中段較短,長0.53μm,寬1.3μm,主要由中心粒、線粒體組成。中心粒1對,短棒狀,位于中段中央,二者相互垂直,分別為近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒。近端中心粒附于核后窩,其長軸方向與精子的長軸垂直;遠(yuǎn)端中心粒,連接精子的尾部,其長軸與精子的長軸平行。中心粒外側(cè)環(huán)繞有5個呈輻射狀或梅花狀排列的球型線粒體;中部橫切,有5個大小不一的線粒體切面;中部縱切,有2個線粒體切面(圖版Ⅱ:2～5)。2.5.3軸絲及原生質(zhì)膜精子的尾部即鞭毛。鞭毛細(xì)長,由前向后逐漸變細(xì)。鞭毛由軸絲及質(zhì)膜構(gòu)成,軸絲由中段的遠(yuǎn)端中心粒發(fā)出,一直貫穿整個尾部,軸絲外包原生質(zhì)膜(細(xì)胞質(zhì)膜)。從縱切和橫切面看,軸絲為典型的“9+2”微管結(jié)構(gòu),即中心是2個中心微管,周圍被9對雙聯(lián)體微管包圍(圖版Ⅱ:5,6)。3精細(xì)胞的變化塔形馬蹄螺精子發(fā)生的過程類似于許多軟體動物雙殼類和其他腹足類[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13],精細(xì)胞經(jīng)歷了一系列的變化,主要包括頂體的形成、細(xì)胞核和線粒體的變化和鞭毛的形成。3.1高爾基體顆粒的變化許多腹足類軟體動物精子具有頂體,也有些腹足類軟體動物精子沒有頂體的形成,塔形馬蹄螺精子具有頂體(圖版Ⅱ:2)。在軟體動物的許多精子中都觀察到高爾基體囊泡融合形成頂體的現(xiàn)象。其形成過程大同小異,大多是由高爾基體分泌的嗜鋨液泡或囊泡(也稱為前頂體顆粒)逐漸融合為前頂體囊,并遷移至核的前端,囊內(nèi)物質(zhì)由絮狀到均質(zhì),密度不斷增加;前頂體囊進(jìn)一步發(fā)育為前頂體,最終演變?yōu)椴煌瑒游锾赜械捻旙w形態(tài)。也有研究資料表明,由高爾基體分泌的前頂體顆粒早在精母細(xì)胞質(zhì)中就已存在。在太平洋牡蠣(Crassostreagigas)等的精母細(xì)胞和早期精細(xì)胞質(zhì)中,還觀察到一些形態(tài)有別于高爾基體液泡的高電子密度的球形顆粒,它們可在精細(xì)胞變態(tài)早期集中融合成前頂體泡,故將這些顆粒也視為前頂體顆粒,頂體的形成依賴于胞質(zhì)中原有前頂體顆粒的融合與整合。在塔形馬蹄螺精子發(fā)生過程各時(shí)期中,高爾基體發(fā)現(xiàn)較少,在精細(xì)胞期也未觀察到前頂體囊泡和大量泡狀體的產(chǎn)生,但在細(xì)胞質(zhì)中觀察到前頂體顆粒物質(zhì)的產(chǎn)生。因此,筆者認(rèn)為塔形馬蹄螺精子頂體的形成不是來自高爾基體,而可能形成于胞質(zhì)中的前頂體顆粒,這與九孔鮑和耳鮑精子頂體的形成相同。3.2染色質(zhì)濃縮和細(xì)胞分化在塔形馬蹄螺精細(xì)胞分化過程中,核的體積和形態(tài)都發(fā)生了較大的變化,經(jīng)歷了核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮、核體積逐漸縮小的過程,兩者是同時(shí)進(jìn)行的。在精細(xì)胞分化過程中,伴隨著染色質(zhì)的聚集濃縮,塔形馬蹄螺精細(xì)胞核的形態(tài)也發(fā)生相應(yīng)的變化,核由橢圓形變?yōu)槁褕A型,再逐漸延長,最后變成與細(xì)胞長軸一致的長圓柱狀,并出現(xiàn)明顯的核內(nèi)凹陷;染色質(zhì)濃縮,細(xì)胞核成為電子密度較高的勻質(zhì)物質(zhì),使核體積縮小,這與九孔鮑和耳鮑精細(xì)胞核的變化類似。染色質(zhì)的濃縮和核體積的縮小,使精子的體積大大變小,這既有利于保存遺傳物質(zhì),也能增強(qiáng)精子的運(yùn)動能力,從而保證受精作用的完成。3.3精母細(xì)胞時(shí)期線粒體是精子能量的供應(yīng)中心場所。隨著精子的發(fā)生、精細(xì)胞的變態(tài),其數(shù)量和體積也發(fā)生了一定的變化?？偟膩碚f,線粒體經(jīng)歷了數(shù)量由少到多、又到少,體積由小到大的變化過程,并在一定時(shí)期匯集于核后方并融合。本研究結(jié)果表明,在精原細(xì)胞時(shí)期,塔形馬蹄螺的線粒體數(shù)目較少,散布于胞質(zhì)中,嵴稀少而短;到初級精母細(xì)胞時(shí)期,線粒體數(shù)量明顯增多,嵴也加長增多;至次級精母細(xì)胞時(shí),線粒體逐漸移向細(xì)胞一端,并開始出現(xiàn)融合,體積由小到大,嵴較密集,基質(zhì)密度也高;進(jìn)入精細(xì)胞時(shí)期,線粒體聚集于核后進(jìn)一步融合為有限的幾個,體積明顯增大,嵴更密集,至變態(tài)后期,線粒體呈飽滿狀,嵴相當(dāng)發(fā)達(dá)。線粒體的變化說明了能量的積累過程和細(xì)胞各階段生命活動的需要。精母細(xì)胞時(shí)期線粒體的增多與細(xì)胞的進(jìn)一步分化有關(guān)。精細(xì)胞分化成精子、線粒體體積增大和嵴數(shù)目增多表明精子在成熟過程中逐步積累了能量,以便為受精做準(zhǔn)備。線粒