硫酸西索米星的雜質(zhì)譜研究

西索米星是20世紀(jì)60年代開(kāi)發(fā)的第一個(gè)含有雙鏈氨基酸的抗生素。它也是一種合成氨基酸并且更有效的母親。氨基糖苷類抗生素也已被用作姐妹劑。它具有良好的療效和低價(jià)格特點(diǎn)。其硫酸鹽制劑在臨床上仍得到廣泛應(yīng)用。國(guó)外西索米星多由伊尼奧氏小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)生;國(guó)產(chǎn)西索米星是由伊尼奧氏小單孢菌澄江變種產(chǎn)生。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上顯示,目前我國(guó)硫酸西索米星原料有5個(gè)廠家生產(chǎn),注射液、注射用粉針等不同劑型有47個(gè)生產(chǎn)批文,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)藥典、日本藥局方及美國(guó)藥典收載,但英國(guó)藥典及國(guó)際藥典未收載。由微生物發(fā)酵的西索米星樣品為對(duì)組分樣品,范明琦等曾從西索米星中分離出6個(gè)極性小組分,測(cè)定硫酸西索米星中有關(guān)物質(zhì)的方法有薄層色譜、HPLC-ELSD等方法,王建等曾采用HPLC-MSn方法探討硫酸西索米星中有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu),可能因流動(dòng)相中三氟乙酸(0.05mol·L-1)對(duì)電噴霧有較強(qiáng)的離子抑制作用,檢測(cè)靈敏度很低,從硫酸西索米星樣品中只檢出1個(gè)雜質(zhì),Li等通過(guò)在流動(dòng)相中添加部分氨水,改善了檢測(cè)靈敏度,但從硫酸西索米星中也只檢出6個(gè)雜質(zhì),但對(duì)硫酸西索米星雜質(zhì)譜的系統(tǒng)研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外未見(jiàn),為此,作者在阿米卡星含量測(cè)定用的HPLC-ELSD色譜條件基礎(chǔ)上,建立了靈敏度高,操作簡(jiǎn)單,適合硫酸西索米星LC-MS分析的堿性流動(dòng)相色譜系統(tǒng),對(duì)硫酸西索米星原料的主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推定,推定方法根據(jù)有無(wú)雜質(zhì)對(duì)照品情況而異:有對(duì)照品的雜質(zhì),通過(guò)比較其與對(duì)照品的色譜和質(zhì)譜行為來(lái)確定結(jié)構(gòu);無(wú)對(duì)照品的雜質(zhì),通過(guò)分析西索米星、奈替米星等類似結(jié)構(gòu)的多級(jí)質(zhì)譜行為,總結(jié)出同類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律,再通過(guò)分析未知雜質(zhì)多級(jí)質(zhì)譜,實(shí)現(xiàn)對(duì)其結(jié)構(gòu)的推定,作者曾采用本思路,對(duì)硫酸奈替米星中主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了推定。1ag內(nèi)部t公司的紡粘設(shè)備Agilent1100LC/MSDTrap液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)。西索米星粗品、硫酸西索米星原料分別由江蘇省不同的生產(chǎn)企業(yè)提供(具體名稱略),奈替米星、西索米星對(duì)照品均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,甲醇為色譜純?cè)噭?其余均為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)方法2.1流動(dòng)相及甲醇b色譜柱:GeminiNXC18(4.6mm×150mm,5μm,美國(guó)Phenomnex公司);以水-氨水-冰醋酸(96∶3.6∶0.4)為流動(dòng)相A,甲醇為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫0～15min,5%B;15～16min,5%→15%B;16～25min,15%B;26～27min,15%→30%B;28～40min,30%B;40～41min,30%→40%B;41～50min,40%B;50～51min,40%→50%B;51～60min,50%B;60～61min,50%→5%B;61～70min,5%B;流速:1mL·min-1;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:20μL。2.2干燥速度ESI離子源;離子源溫度:350℃;霧化室壓力:275.8kPa;干燥氣流速:9L·min-1;離子掃描范圍:100～900m/z;正離子方式檢測(cè),分流模式進(jìn)樣(分流比為3∶2),采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、自動(dòng)全離子掃描二級(jí)質(zhì)譜、手動(dòng)多級(jí)質(zhì)譜3種方式采集奈替米星及有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)譜信息。3結(jié)果3.1西索米星和內(nèi)諾米星的質(zhì)量分析行為對(duì)電噴霧正離子模式下奈替米星和西索米星的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜行為,已有較多的報(bào)道,詳細(xì)裂解過(guò)程可參考文獻(xiàn)。3.2質(zhì)譜條件測(cè)定取硫酸西索米星粗品適量,用水溶解并稀釋制成含西索米星約3mg·mL-1的溶液,分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和二級(jí)質(zhì)譜離子全掃描,圖2為L(zhǎng)C/MS的總離子流圖,有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。3.3西索米星降解產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定物質(zhì)1A、物質(zhì)2及物質(zhì)3的[M+H]+m/z均為469,其二級(jí)質(zhì)譜一致,均為m/z452,434,366,348,324,308,289,205,187,169,163,155,146,145。文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)慶大霉素A、A1、A3的[M+H]+m/z為469,它們的結(jié)構(gòu)如圖4所示,范明琦等曾從西索米星原料藥中分離得到慶大霉素A1及慶大霉素A組分,這三組分的結(jié)構(gòu)均能合理解釋各碎片離子,裂解途徑如圖3所示,對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的確認(rèn)可能需要采用高分辨質(zhì)譜或制備雜質(zhì)對(duì)照品等其他方法。物質(zhì)1B的[M+H]+m/z308,與上述幾慶大霉素A組分脫去A環(huán)降解產(chǎn)物的加氫離子吻合;其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z273,205,187,163,146,用慶大霉素A組分脫A環(huán)降解物各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖4所示,測(cè)定慶大霉素A組分二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z308的三級(jí)質(zhì)譜,也與物質(zhì)1B的二級(jí)質(zhì)譜一致,證明推測(cè)合理,即可將物質(zhì)B歸屬為慶大霉素A的降解物。物質(zhì)4的[M+H]+m/z322,與西索米星脫去A得到的降解產(chǎn)物B+C環(huán)的加氫離子吻合,提示該組分為西索米星失去A環(huán)的降解物,即加洛糖胺(garamine),其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z205,187,163,160,142,118,112各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖5所示,測(cè)定西索米星二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z322的三級(jí)質(zhì)譜,也與物質(zhì)3的二級(jí)質(zhì)譜一致,證明推測(cè)合理,即有關(guān)物質(zhì)4為加洛糖胺。物質(zhì)5的[M+H]+m/z289,與西索米星脫去C得到的降解產(chǎn)物A+B環(huán)的加氫離子吻合,提示該組分為西索米星失去C的降解物,其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z271,254,237,173,163,145,127,109,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖6所示,測(cè)定西索米星二級(jí)質(zhì)譜碎片離子m/z289的三級(jí)質(zhì)譜,也與物質(zhì)4的二級(jí)質(zhì)譜一致,證明推測(cè)合理,證明物質(zhì)5為西索米星脫去C環(huán)得到的降解產(chǎn)物。物質(zhì)6的[M+H]+m/z483,與慶大霉素B的相對(duì)分子質(zhì)量吻合,其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z366,349,324,322,307,294,236,205,187,163,160,145,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖7所示,方金瑞等發(fā)現(xiàn)小單孢菌可以產(chǎn)生慶大霉素B,旁證該結(jié)構(gòu)推定的合理性,即有關(guān)物質(zhì)6為慶大霉素B。物質(zhì)7的[M+H]+m/z482,與文獻(xiàn)報(bào)道的JI-20A的相對(duì)分子質(zhì)量吻合,其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z365,347,323,322,205,203,187,163,160,145,各碎片離子均能得到合理解釋,裂解途徑如圖8所示,有關(guān)物質(zhì)7為JI-20A,其結(jié)構(gòu)與慶大霉素B相似,差別在于慶大霉素B的A環(huán)2位上為羥基,而JI-20A的A環(huán)2位上為氨基。物質(zhì)8(tR=18.8min)和物質(zhì)9(tR=24.6min)均為[M+H]+m/z434,比西索米星的[M+H]+m/z448小14,提示結(jié)構(gòu)中比西索米星少1個(gè)亞甲基。兩物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜主要碎片一致。碎片離子m/z163為西索米星B環(huán)特征離子,m/z271及254為西索米星A+B環(huán)分別脫水、脫氨的特征離子,可見(jiàn),物質(zhì)8、物質(zhì)9的A環(huán)和B環(huán)與西索米星相同,由此推斷,物質(zhì)8、物質(zhì)9的C環(huán)上比西索米星的C環(huán)少1個(gè)亞甲基,西索米星的C環(huán)的3″、4″位上均有可能脫去甲基,但只從二級(jí)質(zhì)譜信息無(wú)法指定這兩物質(zhì)的結(jié)構(gòu)歸屬,為此,分別對(duì)C環(huán)的特征離子m/z146進(jìn)行3級(jí)質(zhì)譜掃描,結(jié)果顯示,物質(zhì)7的m/z146的3級(jí)質(zhì)譜中有明顯的脫氨基峰m/z129,而物質(zhì)8的m/z146的3級(jí)質(zhì)譜中基峰為m/z128,由此可以確定物質(zhì)8和物質(zhì)9的結(jié)構(gòu),如圖9所示,即物質(zhì)8為3″-氮-去甲基西索米星,物質(zhì)9為4-去甲基西索米星。物質(zhì)10的[M+H]+m/z462,比小諾霉素的[M+H]+m/z464小2,推測(cè)其為小諾霉素某個(gè)環(huán)中含有雙鍵,其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z444,427,345,327,303,285,268,251,215,186,173,163,160,其中m/z163為小諾霉素的B環(huán)特征離子,m/z303比小諾霉素對(duì)應(yīng)的脫去C環(huán)特征離子m/z305小2,推測(cè)該雙鍵應(yīng)在A環(huán)上,由西索米星的結(jié)構(gòu)推測(cè)該雙鍵可能在4,5位之間,可能的結(jié)構(gòu)如圖10所示,按該結(jié)構(gòu)能解釋二級(jí)質(zhì)譜中所有碎片離子,表明該結(jié)構(gòu)推測(cè)合理。文獻(xiàn)報(bào)道西索米星產(chǎn)生菌橄欖星小單孢菌可產(chǎn)生威替米星的結(jié)構(gòu)吻合,進(jìn)一步用威大米星對(duì)照品進(jìn)行驗(yàn)證,物質(zhì)10一級(jí)質(zhì)譜、二級(jí)質(zhì)譜及色譜保留時(shí)間與威大米星完全一致,表明推測(cè)合理,即物質(zhì)10為威大米星。物質(zhì)11的[M+H]+m/z447,比西索米星的[M+H]+m/z448小1,推測(cè)其為西索米星類似物,其二級(jí)質(zhì)譜為[M+H]+m/z429,412,330,322,312,288,270,253,227,186,173,163,160,142,其中m/z163為西索米星的B環(huán)特征離子,m/z322為西索米星B+C環(huán)的特征離子,推測(cè)物質(zhì)11的A環(huán)上比西索米星的A環(huán)少1,提示其環(huán)上的氧原子為氮取代,即西索米星的A環(huán)上唯一的連接糖苷的氧原子可能被氮原子取代,物質(zhì)11可能的結(jié)構(gòu)如圖11所示,該結(jié)構(gòu)能解釋二級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子,表明該結(jié)構(gòu)推測(cè)合理。物質(zhì)12及物質(zhì)13A的[M+H]+m/z448,與西索米星相同,二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑也相同,可見(jiàn)它們?yōu)榕c西索米星結(jié)構(gòu)極其相似的同分異構(gòu)體。物質(zhì)13B及物質(zhì)14的一級(jí)質(zhì)譜均為[M+H]+m/z544,但二級(jí)質(zhì)譜完全不同,對(duì)其裂解規(guī)律進(jìn)行分析,與現(xiàn)在能查閱到的氨基糖苷類抗生素?zé)o相似之處,為新發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。3.4硫酸西索米星的雜質(zhì)組成分別取西索米星對(duì)照品、2批硫酸西索米星原料適量,用水溶解并稀釋制成含西索米星約3mg·mL-1的溶液,應(yīng)用建立的HPLC-ESI-IT-MSn分析它們的雜質(zhì)譜,圖12為它們的LC-MS總離子流圖(TIC),結(jié)果顯示,西索米星對(duì)照品品中僅檢出西索米星脫去A環(huán)的加洛糖胺,純度較高,1批硫酸西索米星中檢出7個(gè)雜質(zhì),另外1批硫酸西索米星原料檢出16個(gè)雜質(zhì),采用上述結(jié)構(gòu)分析的思路,各檢出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)均得到歸屬(詳細(xì)結(jié)果略)。這些分析結(jié)果對(duì)生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)發(fā)酵、精制工藝和儲(chǔ)存條件等方面有重要的指導(dǎo)意義。4在含全氟酸流動(dòng)相中增加鹽水4.1因氨基糖苷類抗生素結(jié)構(gòu)中有很多的氨基和羥基,其在反相色譜柱中幾乎不保留,很多文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)在流動(dòng)相添加全氟酸(三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸等)改善這類物質(zhì)的色譜分離,因流動(dòng)相中的全氟酸對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)特別是正離子有強(qiáng)抑制,使得質(zhì)譜中幾乎無(wú)信號(hào),有人建議在柱后添加含丙酸或丁酸的丙醇溶液,即所謂的“TFAfix”技術(shù)解決三氟乙酸對(duì)質(zhì)譜靈敏度抑制問(wèn)題,后因其操作復(fù)雜,人們?cè)趹?yīng)用過(guò)程中逐漸演變?yōu)樵诹鲃?dòng)相中直接添加部分丙酸或丁酸,也有學(xué)者通過(guò)在含全氟酸流動(dòng)相中增加氨水的方法改善靈敏度,在選擇硫酸西索米星雜質(zhì)譜分析的方法時(shí),對(duì)上述方法均進(jìn)行了嘗試,結(jié)果顯示,上述4種方法均適用于硫酸西索米星LC/MS分析,并有足夠的靈敏度,但含全氟酸的流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜儀的污染嚴(yán)重,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需要對(duì)質(zhì)譜儀進(jìn)行全面清洗,否則嚴(yán)重影響后面品種的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度,而作者也曾利用氨基糖苷類抗生素是兩性化合物的特點(diǎn),采用pH10的堿性流動(dòng)相,通過(guò)LC-MS成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)研究依替米星、小諾霉素等原料中雜質(zhì)譜的研究,而堿性流動(dòng)相可以同時(shí)解決分離和檢測(cè)的問(wèn)題,而且對(duì)儀器沒(méi)有污染,優(yōu)于全氟酸的檢測(cè)條件。4.2本研究選用電噴霧離子化方法,分別用正、負(fù)離子模式掃描西索米星溶液,結(jié)果顯示,正離子模式下檢測(cè)靈敏度超乎想象地遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于負(fù)離子檢測(cè)模式,可能是流動(dòng)相中