分子生物學(xué)作業(yè)內(nèi)容：第五章DNA的損傷與修復(fù)制作人：生科四班學(xué)生

陳玥40908199

周紅40908200

李茜40908201

李?yuàn)檴?0908202

李婷婷40908203整理課件第五章DNA的損傷與修復(fù)§1.DNA損傷的產(chǎn)生§2.基因的突變§3.DNA損傷的修復(fù)§4.損傷跨越§5.DNA修復(fù)缺陷與癌癥的關(guān)系整理課件概況作為遺傳物質(zhì)的DNA具有高度的穩(wěn)定性，但是，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境中各種因素依然可以造成DNA的損傷。如果DNA的損傷得不到有效的修復(fù)，就會(huì)造成DNA分子上可遺傳的永久性結(jié)構(gòu)變化，稱為突變〔mutation〕。少數(shù)突變有可能對(duì)細(xì)胞是有利的。但絕大局部突變是有害的。細(xì)胞有多種形式的修復(fù)系統(tǒng)，使絕大多數(shù)損傷能夠及時(shí)修復(fù)。研究DNA損傷與修復(fù)的機(jī)制，有兩個(gè)方面的實(shí)際意義。其一，防止DNA的損傷，是預(yù)防不少疾病的有效途徑。其二，在育種工作中，常常要誘發(fā)突變?cè)俸Y選有優(yōu)良性狀的植株或微生物株系。整理課件§5.1DNA損傷的產(chǎn)生整理課件DNA損傷指在內(nèi)外因素的影響下，體內(nèi)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生的任何改變。假設(shè)堿基的改變是兩種嘌呤或兩種嘧啶之間的互換，稱作轉(zhuǎn)換〔transitions〕。假設(shè)發(fā)生了嘌呤和嘧啶之間的互換，那么稱作顛換〔transversions〕。引起DNA損傷的因素很多，包括DNA分子本身在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的自發(fā)性改變，以及細(xì)胞內(nèi)各種代謝物質(zhì)和外界理化因素引起的損傷。整理課件5.1.1DNA分子的自發(fā)性損傷

DNA的自發(fā)性損傷可以發(fā)生在復(fù)制過(guò)程中，也可以由細(xì)胞自身產(chǎn)生的活性氧或代謝產(chǎn)物造成。根據(jù)DNA損傷的狀況，和引起DNA損傷的原因，可以將DNA的自發(fā)性損傷分作6種類型。整理課件5.1.1.1互變異構(gòu)移位互變異構(gòu)移位〔tautomericshift〕是堿基發(fā)生了烯醇式-酮式結(jié)構(gòu)互變，造成堿基配對(duì)發(fā)生改變，使復(fù)制后的子鏈上出現(xiàn)錯(cuò)誤。生理?xiàng)l件下，堿基上的基團(tuán)主要以酮式和氨基的形式存在，但也可能發(fā)生瞬間的互變異構(gòu)，造成堿基錯(cuò)配。如下圖，假設(shè)A以稀有的亞氨基形式出現(xiàn)，即可與C配對(duì)，經(jīng)過(guò)DNA的兩輪復(fù)制，在1/4的子代分子中，A-T對(duì)變成了G-C對(duì)。因此在DNA復(fù)制時(shí)，假設(shè)模板上出現(xiàn)烯醇式或亞氨基異構(gòu)體時(shí)，子鏈上就可能產(chǎn)生錯(cuò)配的堿基對(duì)。整理課件5.1.1.2自發(fā)脫氨基DNA分子中堿基的環(huán)外氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，結(jié)果使C變?yōu)閁，A變?yōu)镮，G變?yōu)閄〔黃嘌呤〕。在DNA復(fù)制時(shí)，母鏈的上述變化會(huì)在子鏈中產(chǎn)生錯(cuò)誤而導(dǎo)致?lián)p傷。A→I-C，下一輪G-C，引起AT→GC的變；C→U-A，下一輪T-A，引起GC→AT的突變；G→X-C，下一輪G-C，損傷不擴(kuò)大。整理課件5.1.1.3DNA復(fù)制的打滑在DNA復(fù)制時(shí)，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)模板鏈或新生鏈堿基的環(huán)出〔loopingout〕現(xiàn)象，被稱作DNA聚合酶的“打滑〞〔slippage〕。如下圖，第一次復(fù)制時(shí)新生鏈一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的環(huán)出，在第二次復(fù)制時(shí)，可引起同樣數(shù)量堿基的插入。第一次復(fù)制時(shí)模板鏈一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基的環(huán)出，在第二次復(fù)制時(shí)，可引起同樣數(shù)量堿基的缺失。這種錯(cuò)誤易發(fā)生在模板上有堿基串聯(lián)重復(fù)的部位，這些部位即使發(fā)生堿基的環(huán)出，后面的堿甚配對(duì)仍然是正確的。整理課件整理課件5.1.1.4活性氧引起的DNA損傷活性氧指反響活性很高的含氧自由基和H2O2，不少含氧自由基可在細(xì)胞正常代謝過(guò)程中生成。含氧自由基可造成堿基的氧化，如7,8-二氫-8-氧鳥嘌呤〔7,8-oxoG,GO〕就是一種氧化堿基，可與C或A配對(duì)，造成G-C→T-A的顛換，DNApolI和DNApolII的校正活性不能校正其錯(cuò)配，故這種損傷可以積累。整理課件5.1.1.5堿基喪失DNA在生理?xiàng)l件下可通過(guò)自發(fā)性水解，使嘌呤堿和嘧啶堿從磷酸脫氧核糖骨架上脫落下來(lái)。細(xì)胞受熱或pH降低，可加劇脫嘌呤反響，強(qiáng)致癌劑黃曲霉毒素B1也能加劇脫嘌呤反響。整理課件5.1.1.6堿基的烷基化

細(xì)胞內(nèi)一些天然的烷基化試劑，如S-腺苷甲硫氨酸，可使DNA分子中的某些堿基甲基化，造成堿基錯(cuò)配，經(jīng)DNA復(fù)制，形成堿基對(duì)的改變。整理課件5.1.2物理因素引起的DNA損傷DNA分子容易吸收波長(zhǎng)在260nm左右的紫外線〔UV〕，大劑量的UV照射，可以使DNA分子一條鏈上相鄰的兩個(gè)嘧啶共價(jià)結(jié)合，形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體。相鄰的兩個(gè)T或兩個(gè)C，以及C和T之間均可形成嘧啶二聚體，但最易形成的是T-T二聚體和6-4光產(chǎn)物整理課件電離輻射如X射線和γ射線等，可以引起DNA的直接損傷和間接損傷。DNA鏈的斷裂會(huì)隨著照射劑量的增大而加劇。假設(shè)DNA雙鏈中只有一條鏈斷裂，稱為單鏈斷裂，假設(shè)兩條鏈在同一處或緊密相鄰處同時(shí)斷裂，那么為雙鏈斷裂。整理課件5.1.3化學(xué)因素引起的DNA損傷許多天然的或合成的有機(jī)和無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)均可與DNA發(fā)生反響，改變其結(jié)構(gòu)。能誘發(fā)DNA損傷的化學(xué)物質(zhì)稱化學(xué)誘變劑〔mutagen〕，常見(jiàn)的化學(xué)誘變劑可以大致分為3類整理課件5.1.3.1堿基類似物堿基類似物〔baseanalog〕能在DNA復(fù)制時(shí)取代正常堿基與模板鏈的堿基配對(duì)，從而摻人DNA。2-氨基嘌呤〔AP〕是腺嘌呤的類似物，通常與胸腺嘧啶配對(duì)，以罕見(jiàn)的亞氨基狀態(tài)存在時(shí)，可以與胞嘧啶配對(duì)，使A-T變?yōu)镚-C，相反情況下，那么可將G-C變?yōu)锳-T。整理課件5.1.3.2堿基的修飾劑某些化學(xué)物質(zhì)通過(guò)對(duì)DNA分子上堿基的修飾〔basemodification〕，改變其配對(duì)性質(zhì)。例如，亞硝酸能脫去連接在堿基環(huán)上的氨基，使腺嘌呤脫氨基形成次黃嘌呤〔I〕，后者與胞嘧啶配對(duì)，而不與胸腺嘧啶配對(duì)。胞嘧啶脫氨基后成為尿嘧啶，與腺嘌呤配對(duì)。羥胺〔NH2OH〕與DNA分子上堿基的作用特異性很強(qiáng)，它只與胞嘧啶作用，生成4-羥胺胞嘧啶〔HC〕，后者與腺嘌呤配對(duì)，結(jié)果使G-C對(duì)變?yōu)锳-T對(duì)整理課件整理課件烷化劑〔alkylatingagent〕能使DNA堿基上的氮原子烷基化，最常見(jiàn)的是鳥嘌呤第6位氮原子的烷基化，改變堿基配對(duì)性質(zhì)，如6-甲基鳥嘌呤〔MG〕與胸腺嘧啶配對(duì)。如果直接與配對(duì)有關(guān)的基團(tuán)被烷化，那么可完全阻斷復(fù)制時(shí)的堿基配對(duì)。較常見(jiàn)的烷化劑有亞硝胺化合物，包括二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺，亞硝基胍〔NTG〕化合物如N,N′-硝基-N-甲基亞硝基胍，亞硝基脲化合物如乙基亞硝基脲，烷基硫酸鹽化合物，包括二甲基硫酸鹽、乙基甲基硫酸鹽〔EMS〕和乙基乙基硫酸鹽〔EES〕，此外，還有氮芥和硫芥等。整理課件5.1.3.3嵌入染料一些扁平的稠環(huán)分子，如吖啶橙〔acridineorange〕、原黃素〔proflavin〕、溴化乙錠〔ethiduiumbromide,EB〕等染料，可插入到DNA分子堿基對(duì)之間，故稱為嵌入染料〔intercalateddye〕。這些扁平分子插入DNA后正好占據(jù)了一個(gè)堿基的位置，將堿基對(duì)間的距離加大約1倍，可造成DNA兩條鏈的錯(cuò)位。整理課件細(xì)胞內(nèi)存在完善的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，以保障遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。不同類型的DNA損傷，由不同的途徑進(jìn)行修復(fù)。根據(jù)修復(fù)的機(jī)理，DNA損傷的修復(fù)一般可分為直接修復(fù)、切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)、易錯(cuò)修復(fù)和重組修復(fù)等。整理課件1.點(diǎn)突變

點(diǎn)突變指DNA單位分子上所發(fā)生的堿基對(duì)改變，也稱為簡(jiǎn)單突變或單一位點(diǎn)突變，其最主要形式為堿基對(duì)置換，分為轉(zhuǎn)換和顛換兩種類型。有時(shí)，發(fā)生在單個(gè)位點(diǎn)上的少數(shù)核苷酸缺失或插入也被認(rèn)為點(diǎn)突變。

點(diǎn)突變帶來(lái)的后果取決于其發(fā)生

。5.2基因的突變整理課件基因突變是指基因組DNA分子發(fā)生的突然的可遺傳的變異。從分子水平上看，基因突變是指基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對(duì)組成或排列順序的改變?；螂m然十分穩(wěn)定，能在細(xì)胞分裂時(shí)精確地復(fù)制自己，但這種隱定性是相對(duì)的。在一定的條件下基因也可以從原來(lái)的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個(gè)位點(diǎn)上，突然出現(xiàn)了一個(gè)新基因，代替了原有基因，這個(gè)基因叫做突變基因。于是后代的表現(xiàn)中也就突然的祖先從未有的新性狀。整理課件盡管細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)能及時(shí)修復(fù)絕大多數(shù)的DNA損傷，但修復(fù)系統(tǒng)并不是萬(wàn)無(wú)一失的。如果損傷在下一輪DNA復(fù)制之前還沒(méi)有被修復(fù)，有的會(huì)被固定下來(lái)傳給子代細(xì)胞，有的那么通過(guò)易錯(cuò)的跨損傷合成產(chǎn)生新的錯(cuò)誤，并最終也被保存下來(lái)。因此，生物體難免會(huì)發(fā)生這樣那樣的突變，并帶有一定的基因、基因組、細(xì)胞或個(gè)體被稱為突變體。單細(xì)胞生物能夠?qū)⑿庐a(chǎn)生的突變基因直接傳給其后代，而多細(xì)胞生物能否將突變傳給后代那么取決于突變四發(fā)生在生殖細(xì)胞還是體細(xì)胞。如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，那么可以傳給后代。如果是發(fā)生在體細(xì)胞，那么一般不會(huì)傳給后代，除非后代是由突變的體細(xì)胞克隆而成的。整理課件突變的類型5.2.1突變的類型5.2.2突變的回復(fù)和校正5.2.3誘變劑和致癌劑的檢測(cè)整理課件點(diǎn)突變也稱作單堿基替換〔singlebasesubstitution〕，指由單個(gè)堿基改變發(fā)生的突變?？梢苑譃檗D(zhuǎn)換和顛換兩類。轉(zhuǎn)換：嘌呤和嘌呤之間的替換，或嘧啶和嘧啶之間的替換。顛換：嘌呤和嘧啶之間的替換。點(diǎn)突變帶來(lái)的后果取決于其發(fā)生的位置和具體的突變方式。如果是發(fā)生在基因組的垃圾DNA上，因?yàn)槠鋲A基序列缺乏編碼和調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能，就不可能產(chǎn)生任何的后果。如果發(fā)生在一個(gè)基因的啟動(dòng)子或其他基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，那么可能會(huì)影響基因表達(dá)的整理課件〔1〕沉默突變：由于遺傳密碼又兼性，假設(shè)突變的密碼子編碼同樣的氨酸一般對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能沒(méi)有影響同義突變因此被稱為沉默突變或同義突變?！?〕錯(cuò)義突變〔missensemutation〕：堿基對(duì)的置換使mRNA的某一個(gè)密碼子變成編碼另一種氨基酸的密碼子的突變稱為錯(cuò)義突變。錯(cuò)義突變可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)某種蛋白質(zhì)或酶在結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常，從而引起疾病。如人類正常血紅蛋白β鏈的第六位是谷氨酸，其密碼子為GAA或GAG，如果第二個(gè)堿基A被U替代，就變成GUA或GUG，谷氨酸那么被纈氨酸所替代，形成異常血紅蛋白HbS，導(dǎo)致個(gè)體產(chǎn)生鐮形細(xì)胞貧血，產(chǎn)生了突變效應(yīng)整理課件〔3〕無(wú)義突變和通讀突變無(wú)義突變：假設(shè)突變使為氨基酸編碼的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致多肽鏈的合成被中斷。如Cys的密碼子變成TGC突變成終止密碼子TGA。通讀突變：假設(shè)突變使終止密碼子變成了為氨基酸編碼的密碼子，會(huì)使mRNA在翻譯的時(shí)候發(fā)生通讀，從而使肽鏈加長(zhǎng)，也稱加長(zhǎng)突變。

如果突變發(fā)生在蛋白質(zhì)基因的內(nèi)含子序列，一般對(duì)表達(dá)產(chǎn)物沒(méi)影響。但有時(shí)可影響到個(gè)別基因的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后加工或翻譯等。

如果突變發(fā)生在基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)，那么可能影響記憶表達(dá)的效率，甚至完全關(guān)閉基因的表達(dá)，從而引起生物體表現(xiàn)型的變化。整理課件

移碼突變：在正常地DNA分子中,堿基缺失或增加非3地倍數(shù),造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯(cuò)誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。例如原來(lái)的mRNA是GAA、GAA、GAA、GAA……按照密碼子所合成的肽鏈?zhǔn)且粋€(gè)谷氨酸的多肽。如果開頭增加一個(gè)G，那么mRNA就變成了GGA、AGA、AGA、AGA……按照這些密碼子合成的肽鏈就是一個(gè)一甘氨酸開頭的精氨酸的多肽。移碼突變的結(jié)果將引起該段肽鏈的改變，而肽鏈的改變將引起蛋白質(zhì)性質(zhì)的改變，最終引起性狀的變異。嚴(yán)重是會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的死亡。隱性突變和顯性突變隱形突變：在真核生物中，如果只發(fā)生在同源染色體其中的一條上，另一條同源染色體上正?；虻漠a(chǎn)物能夠抵消或中和突變基因?qū)?xì)胞功能的可能的改變。如果突變發(fā)生在同源染色體上的兩個(gè)等位基因都發(fā)生突變，才能改變生物的表現(xiàn)型。顯性突變：在真核生物中有一些基因，只要同源染色體任意一個(gè)等位基因發(fā)生突變，就引起生物的表現(xiàn)型的改變。整理課件校正突變的分類1〕基因內(nèi)校正2〕基因間校正3〕迂回校正5.2.3誘變劑和致癌劑的檢測(cè)整理課件由于基因突變而是生物體的性狀由野生型變?yōu)橥蛔冃?，那么這樣的突變稱作正向突變?；貜?fù)突變(reversemutation):突變體(mutant)經(jīng)過(guò)第二次突變又完全地或局部地恢復(fù)為原來(lái)的基因型和表現(xiàn)型.完全恢復(fù)是由于突變的堿基順序經(jīng)第二次突變后又變?yōu)樵瓉?lái)的堿基順序,故亦稱真正的回復(fù)突變.局部恢復(fù)是由于第二次突變發(fā)生在另一部位上,其結(jié)果是局部恢復(fù)原來(lái)的表現(xiàn)型.亦稱為第二位點(diǎn)突變(secondsitemutation)或基因內(nèi)校正(intragenicsuppression)校正突變：指發(fā)生在另外一個(gè)位點(diǎn)上，且能夠中和或抵消起始突變的第二次突變。整理課件

誘變劑和致癌劑的檢測(cè)

自然條件下發(fā)生的突變稱為自發(fā)突變，其發(fā)生的頻率非常低，大腸桿菌和果蠅的自發(fā)突變率都在10左右。能夠提高突變率的誘變劑主要有物理誘變劑和化學(xué)誘變劑兩類。

物理誘變劑通過(guò)離子輻射如吸收X射線和r射線，引起目標(biāo)分子的電子轉(zhuǎn)移，造成DNA發(fā)生廣泛的損傷?；瘜W(xué)誘變劑主要是通過(guò)對(duì)堿基的修飾、堿基對(duì)的插入或缺失起作用。

原癌基因：控制細(xì)胞分裂的基因發(fā)生突變繼而引發(fā)癌變，這樣的基因稱為原癌基因。

抑癌基因：表達(dá)的產(chǎn)物有抑制癌癥的作用的基因。整理課件Ames試驗(yàn)污染物對(duì)人體的潛在危害，引起人們的普遍關(guān)注。世界上已開展了百余種短期快速測(cè)試法，檢測(cè)污染物的遺傳毒性效應(yīng)。目的和原理鼠傷寒沙門氏菌〔Salmonellatyphimurium〕的組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型〔his－〕菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見(jiàn)到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見(jiàn)的菌落。某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測(cè)試系統(tǒng)中參加哺乳動(dòng)物微粒體酶①，可彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)之缺乏。鑒于化學(xué)物質(zhì)的致突變作用與致癌作用之間密切相關(guān)，故此法現(xiàn)廣泛應(yīng)用于致癌物的篩選。整理課件步驟和方法

Ames試驗(yàn)的常規(guī)方法有斑點(diǎn)試驗(yàn)和平板摻入試驗(yàn)。

1．菌株鑒定用于測(cè)試的菌株，需經(jīng)基因型和生物學(xué)性狀鑒定，符合要求才能投入使用。

目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102自發(fā)回變相似，為陰性。。鑒定前先進(jìn)行增菌培養(yǎng)。為鑒定結(jié)果可靠，需同時(shí)培養(yǎng)野生型TV菌株，作為測(cè)試菌基因型之對(duì)照。增菌培養(yǎng)用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，接種后于37℃，100r／min振蕩培養(yǎng)12h左右，細(xì)菌生長(zhǎng)相為對(duì)數(shù)期末，含菌數(shù)應(yīng)為1×109個(gè)／ml～2×109個(gè)／ml。

2．斑點(diǎn)試驗(yàn)吸取測(cè)試菌增菌培養(yǎng)后的菌液0.1ml，注入融化并保溫45℃左右的上層軟瓊脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，立即混勻，傾于底平板上，鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣，紙片浸濕受試物溶液，或直接取固態(tài)受試物，貼放于上層培養(yǎng)基的外表。同時(shí)做溶劑對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，分別貼放于平板上相應(yīng)位置。平皿倒置于37℃溫箱培養(yǎng)48h。在紙片外圍長(zhǎng)出密集菌落圈，為陽(yáng)性；菌落散布，密度與自發(fā)回變相似，為陰性。

整理課件3．平板摻入試驗(yàn)將一定量樣液和0.1ml測(cè)試菌液均參加上層軟瓊脂中，需代謝活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時(shí)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，每種處理做3個(gè)平行。試樣通常設(shè)4個(gè)～5個(gè)劑量。選擇劑量范圍開始應(yīng)大些，有陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，再在較窄的劑量范圍內(nèi)確定劑量反響關(guān)系。培養(yǎng)同上。同一劑量各皿回變菌落均數(shù)與各陰性對(duì)照皿自發(fā)回變菌落均數(shù)之比，為致變比〔MR〕。MR值≥2，且有劑量-反響關(guān)系，背景正常，那么判為致突變陽(yáng)性。整理課件§5.3DNA損傷的修復(fù)整理課件5.3.1直接修復(fù)直接修復(fù)也稱為損傷逆轉(zhuǎn)，其修復(fù)的方式是用特定的化學(xué)反響使受損傷的堿基恢復(fù)為正常的堿基，是最簡(jiǎn)單、最直接的修復(fù)方式。能被這種機(jī)制修復(fù)的損傷有嘧啶二聚體、6-烷基鳥嘌呤和某些鏈的斷裂。整理課件5.3.1.1嘧啶二聚體的直接修復(fù)嘧啶二聚體是一種常見(jiàn)的DNA損傷，可導(dǎo)致雙螺旋發(fā)生扭曲，而影響DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。嘧啶二聚體既可被直接修復(fù)，也可被切除修復(fù)。參與其直接修復(fù)的酶是DNA光復(fù)活酶或光裂解酶。該酶廣泛存在于原核和真核生物的細(xì)胞中，是Mr為5.5×104~6.5×104

的單體酶

，含兩個(gè)光吸收輔因子和FADH。一旦嘧啶二聚體被直接修復(fù)，光裂解酶就與DNA解離。

光復(fù)活酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、果蠅、植物和很多脊椎動(dòng)物中，但在哺乳動(dòng)物中卻沒(méi)有這種酶，因而不能進(jìn)行嘧啶二聚體的直接修復(fù)。

整理課件5.3.1.2烷基化堿基的直接修復(fù)烷基化堿基的直接修復(fù)是在烷基化轉(zhuǎn)移酶的作用下完成的，E.coli中的6-烷基鳥嘌呤、4-烷基胸腺嘧啶和甲基化的磷酸二酯鍵由Ada酶直接修復(fù)。Ada酶以活性中心的1個(gè)Cys殘基為甲基受體，但是一旦它得到甲基，酶就失活，因此是一種自殺酶，可是這個(gè)修復(fù)途徑只需一步反響。此外，這種損傷可以由DNA連接酶直接修復(fù).整理課件5.3.2切除修復(fù)切除修復(fù)〔excisionrepair)需要先識(shí)別損傷部位，然后切除損傷的堿基或核苷酸，用正常的堿基或核苷酸填補(bǔ)缺口，用連接酶連接切口。切除修復(fù)有兩種：a.堿基切除修復(fù)b.核苷酸切除修復(fù)兩者識(shí)別損傷的機(jī)制不同，前者是直接識(shí)別具體的受損傷的堿基，后者識(shí)別的是損傷對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的扭曲。整理課件5.3.2.1堿基切除修復(fù)堿基切除修復(fù)〔baseexcisionrepair,BER〕首先作用于N-糖苷鍵，切除受損傷的堿基，比方尿嘧啶、次黃嘌呤、烷基化堿基、被氧化的堿基和其他一些被修飾的堿基等，隨后，再進(jìn)行進(jìn)一步的修復(fù)反響。BER適用范圍：較輕的堿基損傷催化堿基切除的酶：DNA糖苷酶幾乎所有的DNA糖苷酶都只作用于單個(gè)損傷堿基。不過(guò)，在T4噬菌體和黃色微球菌中發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)嘧啶二聚體特異性的糖苷酶。DNA糖苷酶的特異性有所差異，但所有的DNA糖苷酶都是沿著DNA雙螺旋的小溝進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)受損傷的堿基后即與DNA結(jié)合，并誘導(dǎo)DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲，使損傷堿基被擠出雙螺旋，進(jìn)入酶的活性中心進(jìn)行切割。

整理課件DNA分子經(jīng)DNA糖苷酶作用產(chǎn)生無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)〔apurinic或apyridimidicsite,AP位點(diǎn)〕。該位點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)專門的AP內(nèi)切酶〔APendonuclease〕的有效底物。有兩類AP內(nèi)切酶：a.5‘-AP內(nèi)切酶，在AP位點(diǎn)的5’-端切割產(chǎn)生3‘-OH和5’-脫氧核糖磷酸，脫氧核糖磷酸隨后被DNA脫氧核糖磷酸二酯酶〔DNAdeoxyribophosphodiesterase,dRPase〕切除。b.3‘-AP內(nèi)切酶，它們?cè)贏P位點(diǎn)的3’端切開磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3‘-不飽和醛〔unsaturatedaldehydes〕和5’-脫氧核苷酸，3‘-不飽和醛隨后被5’-AP內(nèi)切酶切除。DNA糖苷酶也可分作兩類,一類只有N-糖苷酶的活性，另一類除具有N-糖苷酶活性外，還有3‘-AP裂解內(nèi)切酶活性〔3’-APlyaseendonuclease〕，可作用于無(wú)嘌呤或無(wú)嘧啶位點(diǎn)。整理課件在損傷部位形成切口后，可以通過(guò)兩種途徑進(jìn)行修復(fù)合成。

a.短修復(fù)途徑

b.長(zhǎng)修復(fù)途徑兩種途徑的異同點(diǎn)：

1.AP內(nèi)切酶的切口都緊靠AP位點(diǎn)5‘-端的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生5’-脫氧核糖磷酸和3‘-OH。

2.短修補(bǔ)是主要途徑，只需合成屬于AP。位點(diǎn)的1個(gè)正常的核苷酸；長(zhǎng)修補(bǔ)時(shí)次要途徑，是前者的備用途徑，要合成1小段寡聚核苷酸。

3.短修補(bǔ)用DNApolβ，長(zhǎng)修補(bǔ)用DNApolδ或PCNA。整理課件整理課件5.3.2.2核苷酸切除修復(fù)

核苷酸切除修復(fù)〔nucleotideexcisionrepair,NER〕主要用來(lái)修復(fù)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲并影響到DNA復(fù)制的損傷，由于NER識(shí)別損傷的機(jī)制并不是針對(duì)損傷本身，而是針對(duì)損傷對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)造成的扭曲，故許多并不相同的損傷能被相同的機(jī)制和幾乎同一套修復(fù)蛋白修復(fù)。整理課件盡管在真核生物體內(nèi)參與NER的蛋白質(zhì)高度保守，但與原核生物的相關(guān)蛋白質(zhì)同源性卻很低。不過(guò)，原核生物和真核生物NER的根本過(guò)程是相似的，主要由5步反響組成：1.由特殊的蛋白質(zhì)探測(cè)損傷，并引發(fā)一系列蛋白質(zhì)與損傷部位的有序結(jié)合。2.由特殊的內(nèi)切酶在損傷部位的兩側(cè)切開DNA鏈。3.去除2個(gè)切口之間的帶有損傷的DNA片段，形成缺口。4.由DNApol填補(bǔ)缺口。5.由DNA連接酶連接切口。整理課件全基因組NER和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER根據(jù)識(shí)別損傷的機(jī)制和修復(fù)的范圍，可以將NER分為全基因組NER〔globalgenomeNER,GGR〕和轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)性NER〔transcription-coupledNER,TCR〕。兩者的異同點(diǎn)：GGR負(fù)責(zé)修復(fù)整個(gè)基因組的DNA損傷，速度慢，效率低。TCR專門修復(fù)正在轉(zhuǎn)錄的基因模板鏈上的損傷，速度快，效率高。兩類NER的主要差異在于識(shí)別損傷的機(jī)制上，至于損傷識(shí)別后發(fā)生的修復(fù)反映并無(wú)本質(zhì)上的區(qū)別。TCR由RNA聚合酶識(shí)別損傷部位。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到受損傷部位而前進(jìn)受阻的時(shí)候，TCR即被起動(dòng)。

整理課件〔1〕原核細(xì)胞的NER系統(tǒng)E.coli的嘧啶二聚體可以通過(guò)GGR系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，該系統(tǒng)需要的酶和蛋白質(zhì)如表5-1所示，其根本步驟如圖5-11所示。①2個(gè)UvrA與1個(gè)UvrB形成三聚體，此過(guò)程需要水解ATP來(lái)提供能量。②UvrA2-UvrB1復(fù)合物與DNA隨機(jī)結(jié)合后受ATP水解驅(qū)動(dòng)，在DNA分子上移動(dòng)，對(duì)DNA的損傷進(jìn)行監(jiān)控。③一旦發(fā)現(xiàn)損傷，那么UvrA解離，UvrB與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，接著，UvrC與UvrB-DNA位點(diǎn)高親和性結(jié)合，誘導(dǎo)UvrB的構(gòu)象發(fā)生變化，使之在損傷部位的3‘-端〔距離損傷點(diǎn)4個(gè)核苷酸〕產(chǎn)生切口。隨后，UvrC催化在DNA損傷部位的5’-端〔距離損傷點(diǎn)7～8個(gè)核苷酸〕產(chǎn)生切口，在UvrD解鏈酶的催化下，釋放一個(gè)由12nt～13nt組成的寡聚核苷酸片段。④由DNApolI填補(bǔ)缺口，連接酶連接切口。整理課件表5-1原核細(xì)胞NER系統(tǒng)蛋白質(zhì)和酶的功能蛋白質(zhì)功能UvrA識(shí)別損傷并充當(dāng)分子接頭UvrB識(shí)別損傷并在3'-端切開DNA鏈UvrC在損傷部位的5'-端切開DNA鏈UvrD解鏈酶DNApolI/II填補(bǔ)缺口DNA連接酶連接切口整理課件整理課件TCR最初是在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，后來(lái)證明也存在于原核細(xì)胞。如果缺乏TCR，那么DNA的轉(zhuǎn)錄股與非轉(zhuǎn)錄股修復(fù)的效率應(yīng)該沒(méi)有差異。但關(guān)于E.coli乳糖操縱子DNA損傷修復(fù)的研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)物IPTG存在的情況下，其轉(zhuǎn)錄股由UV誘發(fā)的損傷在5分鐘內(nèi)被全部修復(fù)，而非轉(zhuǎn)錄股的損傷，或無(wú)IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞，其損傷約需要40分鐘才能被修復(fù)。轉(zhuǎn)錄股更容易修復(fù)，是因?yàn)槠鋼p傷更容易被識(shí)別。在E.coli的TCR系統(tǒng)中，一旦RNA聚合酶進(jìn)入損傷部位，其轉(zhuǎn)錄就暫停，并形成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物。Mfd基因的產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄修復(fù)偶聯(lián)因子〔transcriptionrepaircoupledfactor,TRCF〕識(shí)別這種暫停的復(fù)合物，取代RNA聚合酶，同時(shí)將UvrA2-UvrB1復(fù)合物招募到損傷部位，并促進(jìn)UvrA與UvrB解離，從而加快UvrB-DNA預(yù)剪切復(fù)合物的形成。隨后損傷被切除，以及填補(bǔ)缺口和連接切口的反響與GGR完全相同〔圖5-12〕。整理課件整理課件〔2〕真核細(xì)胞的NER系統(tǒng)〔2〕真核細(xì)胞的NER系統(tǒng)真核細(xì)胞的NER系統(tǒng)大概需要30多種蛋白質(zhì)參與，但是，修復(fù)的根本原理和過(guò)程與原核細(xì)胞非常相似。與原核細(xì)胞的NER模型相似，真核細(xì)胞的NER涉及多個(gè)步驟，雖然各種蛋白質(zhì)結(jié)合的次序還存有一定的爭(zhēng)議，哺乳動(dòng)物GGR系統(tǒng)的根本步驟是比較明確的。整理課件①XPC和HR23B形成二聚體，識(shí)別并結(jié)合到DNA的傷部位，使雙螺旋的扭曲加劇。②TFIIH,RPA和XPA與雙螺旋嚴(yán)重扭曲的損傷部位結(jié)合，形成約20bp～30bp的單鏈區(qū)域，RPA作為SSB與已解開的單鏈區(qū)域結(jié)合。③XPG和XPF/ERCCl作為對(duì)DNA結(jié)構(gòu)特異性的內(nèi)切酶，被招募到已解鏈的損傷部位，④XPB/XPD的解鏈酶活性協(xié)助2個(gè)切點(diǎn)之間包含損傷部位的寡聚核苷酸(平均長(zhǎng)度為27nt)脫離復(fù)合物。⑤DNApo1δ或ε與PCNA一起進(jìn)行修補(bǔ)合成，填補(bǔ)缺口。最后，連接酶連接切口。哺乳動(dòng)物TCR系統(tǒng)識(shí)別損傷的機(jī)制與GGR系統(tǒng)不同，首先，RNA聚合酶II延伸復(fù)合物暫停在損傷部位，并導(dǎo)致一小局部區(qū)域發(fā)生解鏈。隨后，CSA和CSB被招募到RNA聚合酶上，進(jìn)而協(xié)助招募TFIIH,XPA,RPA和XPG到損傷部位，RNA聚合酶、RNA轉(zhuǎn)錄物、CSA和CSB那么解離下來(lái)，于是形成了與GGR一樣的復(fù)合物，后續(xù)的步驟與GGR系統(tǒng)完全相同(圖5-13)。整理課件整理課件5.3.3錯(cuò)配修復(fù)錯(cuò)配修復(fù)〔MMR〕系統(tǒng)主要用來(lái)糾正DNA雙螺旋上錯(cuò)配的堿基對(duì)，此外，還能修復(fù)一些因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。此途徑的缺陷可產(chǎn)生所謂的突變子表型，表現(xiàn)為細(xì)胞的自發(fā)突變率和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性增高。MMR的過(guò)程與其他切除修復(fù)途徑相似，但與其他修復(fù)系統(tǒng)不同的是MMR系統(tǒng)需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯(cuò)誤的核苷酸，而不會(huì)切除母鏈中本來(lái)就正確的核苷酸整理課件E.coli的MMR長(zhǎng)修補(bǔ)途徑需要多種蛋白質(zhì)，MutS負(fù)責(zé)識(shí)別錯(cuò)配的堿基對(duì)，識(shí)別效率取決于錯(cuò)配堿基對(duì)的類型和所處的環(huán)境。此外，長(zhǎng)修補(bǔ)途徑還需要特殊的核酸外切酶，DNApolⅢ和DNA連接酶。其MMR作用的主要步驟如下：1)MutS識(shí)別并結(jié)合錯(cuò)配的堿基對(duì)，或因堿基插入或缺失在DNA上形成的小環(huán)，MutL隨后結(jié)合。2)MutH與GATC位點(diǎn)結(jié)合，在錯(cuò)配堿基對(duì)兩側(cè)的DNA通過(guò)MutS做相向移動(dòng)，形成雙鏈突環(huán)。3〕MutHa的核酸內(nèi)切酶活性被MutS/MutL激活，切割非甲基化子鏈的GATC的5-端。整理課件4〕UvrD作為解鏈酶，催化唄切開的含有錯(cuò)配堿基的子鏈與母鏈別離。5〕DNApolⅢ和連接酶分別填補(bǔ)缺口和連接切口。錯(cuò)配修復(fù)是一個(gè)高耗能的過(guò)程。E.coli還有另外兩條不需要MutS,MutL和MutH的短修補(bǔ)MMR途徑：Ⅰ.依賴于MutY的修復(fù)途徑，用于取代A-G和A-C錯(cuò)配堿基對(duì)中的A。Ⅱ.極短修補(bǔ)途徑，用于糾正G-T錯(cuò)配堿基對(duì)中的T。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，也存在一種類似的短修補(bǔ)MM途徑，用來(lái)糾正其甲基化的CpG島上因脫氨基產(chǎn)生的G-T錯(cuò)配堿基對(duì)上的T。

整理課件5.3.4雙鏈斷裂的修復(fù)DNA斷裂特別是雙鏈斷裂時(shí)一種極為嚴(yán)重的損傷，這種損傷難以徹底修復(fù)。雙鏈斷裂修復(fù)主要有兩種機(jī)制：其一是同源重組，精確性高；其二為非同源末端連接，能在無(wú)同源序列的情況下，讓斷裂的末端重新連接起來(lái)，這種方式精確性低，但卻是人類修復(fù)雙鏈斷裂的主要方式。整理課件NHEJ是DSBR中最簡(jiǎn)單和最常用的一種方式，其根本步驟如下:1〕2個(gè)Ku70/K80異源二聚體與2個(gè)DNA斷裂末端結(jié)合。2〕DNA-PKcs與Artemis蛋白形成合物，被Ku70/K80招募到DNA末端，并使斷裂的DNA相互靠近。3〕DNA-PKcs與DNA末端結(jié)合后，其蛋白質(zhì)既沒(méi)的活性被激活，使Artemis蛋白磷酸化。4〕Artemis蛋白被磷酸化后，其核酸酶活性被激活，可水解末端突出的單鏈區(qū)域，創(chuàng)造出連接酶的有效底物。5〕XRCC4和連接酶ⅳ共同催化已加工好的DNA末端之間的連接整理課件§5.4損傷跨越整理課件損傷跨越〔damagebypass〕：DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的損傷，無(wú)法修復(fù)時(shí)，在暫時(shí)保存損傷的情況下，繼續(xù)復(fù)制，復(fù)制結(jié)束后再進(jìn)行修復(fù)，由于這一機(jī)制是事先合成錯(cuò)誤率較高的DNA，再對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，故也可被稱作易錯(cuò)修復(fù)。特點(diǎn)：保存損傷，先復(fù)制，再修復(fù)。整理課件5.4.1重組跨越重組跨越(recombinationalbypass)又稱為重組修復(fù)(recombinationrepair〕，其根本機(jī)制是通過(guò)對(duì)DNA模板的交換，跨越模板鏈上的損傷部位，在新合成的鏈上恢復(fù)正常的核苷酸序列。重組跨越雖然沒(méi)有消除模板鏈上損傷，但也沒(méi)有在復(fù)制過(guò)程中擴(kuò)大損傷。模板鏈上的損傷可以在復(fù)制完成后，用其它途徑進(jìn)行修復(fù)。整理課件E.coli重組跨越的兩種機(jī)制：

第一種：在新鏈合成遇到損傷部位時(shí)，通過(guò)蛋白質(zhì)RecA,RecF,RecO和RecR的作用，使復(fù)制叉后退，兩條新合成的鏈回折，形成互補(bǔ)雙鏈。接著，因模板鏈上的損傷而中斷合成的新鏈，以另一條新鏈為模板，在DNApolI的催化下進(jìn)行鏈的延伸，隨后，復(fù)制叉向前移動(dòng)，跨越損傷部位，進(jìn)行正常的復(fù)制。如圖5—17

整理課件第二種：一旦復(fù)制叉到達(dá)損傷位點(diǎn)如嘧啶二聚體，或模板鏈斷裂，DNApol即停止移動(dòng)并與模板鏈解離，另一條模板鏈在RecA,RecF,RecO和RecR的作用下斷裂，并與受損傷的模板鏈形成互補(bǔ)雙鏈，在跨越損傷部位后繼續(xù)合成新鏈，然后在RuvA,RuvB和RuvC的作用下，鏈的交叉部位遷移，在斷裂的模板鏈上留下的一段缺口，由DNApolI和連接酶修補(bǔ)。其后，DNA復(fù)制可按正常機(jī)制完成。這一機(jī)制形成鏈交