PAGEPAGE1《微生物檢驗學》教學實驗通過教學實驗，了解食品檢驗中微生物檢測部分的基本方法，要求學生通過實踐操作的訓練，掌握食品檢驗中微生物檢測技術(shù)的基本操作技能。熟練掌握培養(yǎng)基配制、高壓蒸汽滅菌技術(shù)、無菌操作技術(shù)和菌數(shù)計數(shù)、生化鑒定等技術(shù)，使學生具有較強的實際操作能力。【目的要求】熟練掌握培養(yǎng)基制備與滅菌、無菌操作技術(shù)掌握細菌菌落計數(shù)方法掌握大腸菌群的識別與分離技術(shù)【實驗內(nèi)容】培養(yǎng)基制備與滅菌水質(zhì)的取樣和制備（無菌操作技術(shù)）細菌菌落總數(shù)的計數(shù)與結(jié)果分析大腸菌群的初發(fā)酵試驗與分離培養(yǎng)大腸菌群的革蘭氏染色、復發(fā)酵試驗和結(jié)果分析【實驗方法】一、培養(yǎng)基制備與滅菌1.學生分為若干組，每組配備一套培養(yǎng)基、并經(jīng)高壓鍋蒸汽滅菌。2.學生獨立完成玻璃器皿的包扎和干熱滅菌二、水樣的采集與制備1．采集實驗室的自來水樣2．采集自來水制備的水源水（閩江水）和校內(nèi)觀音湖水樣三、細菌菌落總數(shù)測定（標準平板活細胞計數(shù)法，SPC）1.水樣的稀釋、制備和培養(yǎng)2.細菌菌落計數(shù)方法3.細菌菌落計數(shù)的報告四、大腸菌群檢驗：1.生活飲用水或食品廠生產(chǎn)用水的檢驗2.水源水（閩江水）和校內(nèi)觀音湖水水樣（1）初步發(fā)酵試驗（2）分離培養(yǎng)（3）證實試驗（4）根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查表計算出大腸菌群最可能數(shù)。五、寫出水質(zhì)檢驗的結(jié)果，并評價所檢測的水質(zhì)質(zhì)量狀況。水質(zhì)衛(wèi)生檢驗一、水樣的采集1.自來水先將水龍頭用清潔布拭干，并用攝子夾消毒棉花沾酒精灼燒水龍頭3min滅菌，再打開水龍頭使水流5min后，以滅菌的三角瓶或生理鹽水瓶接取水樣，以待檢測。2.池水、河水或湖水應取距水面10～15cm的深層水，先將滅菌的帶塞的玻璃瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，除去瓶塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞塞好，再從水中取出，最好立即檢驗，否則需放入冰箱保藏。二、細菌菌落總數(shù)測定（SPC）1.樣品稀釋與制備（1）自來水：用滅菌吸管吸取1mL水樣，注入滅菌的培養(yǎng)皿中，共做兩個平皿。然后倒入約15mL已溶化并冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并輕輕搖晃，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待冷卻后倒置于36±1（2）池水、河水或湖水等：用無菌吸管吸取檢測水樣1mL于第一支9mL生理鹽水試管中，搖勻，再從第1支稀釋試管中吸取1mL于第2支生理鹽水的試管中，如此類推，做成一系列的稀釋液。一般稀釋度可選擇為10-1、10-2、10-3、10-4，若水樣混濁或污染嚴重的可再進一步稀釋至適宜稀釋度。自最后三個稀釋度的試管中各吸取1mL稀釋液于培養(yǎng)皿中，每稀釋度做二個平皿，傾注入約15mL已溶化并冷卻至45℃左右的營養(yǎng)瓊脂，并輕晃平皿，使之混勻，待冷卻后倒置于36±12.菌落計數(shù)方法待平皿培養(yǎng)24h長出菌落后作平皿菌落計數(shù)，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏，在記下各皿的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的2個平皿的平均菌落數(shù)。3.菌落計數(shù)的報告：①平皿菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30～300之間的平皿作為菌落總數(shù)測定標準，一個稀釋度使用兩個平皿應采用其平均數(shù)，其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可計算半個平皿后乘2以代表全皿菌落數(shù)。②稀釋度的選擇：a.應選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例1)。b.若有兩個稀釋度，其生長之菌落數(shù)均在30～300之間，則應視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應報告其平均數(shù)：若大于2則報告其中較小的數(shù)字(見表例2及3)。c.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例4)d.若所有釋稀度的平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例5)。e.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之(見表例6)。f.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于(＜)1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之(見表例7)。細菌菌落總數(shù)計算方法（SPC法）例次不同稀釋度平均CFU兩稀釋度CFU之比菌落總數(shù)報告CFU/mL(g)備注10-110-210-31135616420－16400或1.6X104兩位以后的數(shù)字采用四舍五入的方法去舍。22760295461.637750或3.8X10432890271602.227100或2.7X1044＜30001650513－513000或5.1X105527115－270或2.7X1026無法計數(shù)30512－30500或3.5X1047000＜10③菌落數(shù)的報告：菌落數(shù)小于10，按＜10報告；在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。三、大腸菌群檢驗：大腸菌群系指一群在36±1℃24h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧G-無芽孢桿菌，包括埃希氏大腸桿菌、克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌和檸檬酸桿菌等。水中大腸菌群數(shù)系以每1L水樣中大腸菌群最近似數(shù)(M.P.N)瓶裝水、飲用水、水源水和游泳池水衛(wèi)生標準水源大腸菌群(個/L)CFU/mL瓶裝水（礦泉水、純凈水）＜2＜50飲用（自來）水＜2＜100水源水準備加氯消毒后供飲用的水≤1000準備凈化處理及加氯消毒后供飲用的水≤10000游泳池水＜100＜1000生活飲用水或食品廠生產(chǎn)用水的檢驗：（1）初步發(fā)酵試驗在2個各裝有50mL叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，各加入100mL水樣，將10支含有5mL叁倍乳糖蛋白胨發(fā)酵管中各加入10mL水樣，于36±1℃培養(yǎng)24h，24h未產(chǎn)氣者繼續(xù)培養(yǎng)至48h。若水質(zhì)條件變化不大的飲用水（或生產(chǎn)用水）可采用3個裝有50mL叁倍濃縮的十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管分別加入100mL（2）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美蘭瓊脂平板，置36±1℃培養(yǎng)18～24（3）證實試驗在上述平板上，挑取在此平板生長符合上述特征的菌落，或可疑無法判斷的菌落1～2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃培養(yǎng)24±2h，（4）根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查下列表。飲用水大腸菌群檢索表（接種水樣總量300mL，其中100mL2份，10mL10份）100mL水樣陽性管數(shù)10mL水樣陽性管數(shù)012個/L個/L個/L0＜3411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069＞230大腸菌群變異不大的飲用水檢索表陽性管數(shù)0123接種水樣總量300mL（3份100mL）1L水樣中大腸菌群數(shù)＜3411＞182．池水、河水或湖水等水源水的檢驗將水樣稀釋成10-1、10-2。分別吸取1mL的10-1、10-2的稀釋水樣和1mL原水樣，各注入裝有10mL單料乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，另取10mL原水樣注入裝有5mL叁倍十二烷基硫酸鈉乳糖蛋白胨發(fā)酵管中（接種水量為11.11mL，若水源水嚴重污染則取樣量應為1.111mL，即原水樣、10-1、10-2、10-3；若污染輕度水取樣為111.1mL，即100倍原水樣、10倍原水樣、原水樣和10-1）。置36±1℃培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況，若有產(chǎn)氣者則按上述的分離培養(yǎng)與證實試驗進行，最后根據(jù)產(chǎn)氣管數(shù)查表報告。四、培養(yǎng)基配方：（1）生理鹽水NaCl9g水1000（2）伊紅美蘭培養(yǎng)基（EMB）蛋白胨水瓊脂培養(yǎng)基100mL（蛋白胨10gNaCl5g瓊脂20g水1000mLpH7.6121℃乳糖2g2%伊紅液2mL0.65%美蘭液1mL將已滅菌的蛋白胨水瓊脂溶化，冷卻至60℃左右時，按無菌操作加入乳糖、伊紅液和美蘭液（這三種應分別在115（3）乳糖發(fā)酵液（供復發(fā)酵用）蛋白胨10g乳糖5gNaCl5g水1000mLpH7.4營養(yǎng)瓊脂蛋白胨10g牛肉膏3gNaCl5g瓊脂20g水1000mLpH7.0-7.2121℃20min。（5）單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5gNaCl5g1.6%溴甲酚紫乙醇液1mL十二烷基硫酸鈉0.1g水1000mLpH7.2～7.4將上述除指示劑外溶于水，調(diào)pH7.2～7.4，再加入指示劑。（6）叁料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方：按單料十二烷基硫酸鈉乳糖發(fā)酵液配方要求各營養(yǎng)成分為叁倍，而加水不變。水源水大腸菌群檢索表接種水量11.11mL，分別為10、1、0.1和0.01