破解呼吸道感染病原學診斷的困境：需要你我他王

輝北京大學人民醫(yī)院檢驗科Email：whuibj@163.comL.CN.MKT.GM.04.2016.50591可編輯課件PPT內容

呼吸道感染病原學

困境和挑戰(zhàn)可能的破解之道22可編輯課件PPTTheThreeMostImportantElementsinPracticingMedicineWilliamOsler,ThePrinciplesandPracticeofMedicine,1892Diagnosis!Diagnosis!Diagnosis!

Medicineisascienceofuncertaintyandanartofprobability.

最重要的是不要看遠方模糊的事，而是做好手頭清楚的事

3可編輯課件PPT歐洲流調：CAP的主要病原體病原體檢出率(%)一項1996年11月至2008年7月在西班牙進行的CAP流調研究，納入3,524例CAP患者(15%門診患者,85%住院患者)，其中1,463例患者病原學呈陽性反應。CillónizC,etal.Thorax.2011;66(4):340-346.肺炎鏈球菌和非典型病原體是CAP最主要致病菌，混合感染占重要地位N=14634可編輯課件PPT

我國CAP的主要致病菌病原體檢出率(%)入選2003年12月至2004年11月中國7個城市12個中心的665例CAP患者并進行病原體檢測2006年我國CAP的大型流調研究顯示：肺炎支原體是我國CAP的最主要致病菌，其次為肺炎鏈球菌1在我國已經完成的另兩項全國多中心成人CAP調查中，肺炎支原體感染的比例分別達到了20.7%和38.9%，均已超過了肺炎鏈球菌(分離率分別為10.3%和14.8%)，成為成人CAP最常見的致病原2,3混合感染在社區(qū)呼吸道感染中占有重要地位，以細菌合并非典型病原體混合感染居多11.劉又寧陳民鈞趙鐵梅等.中華結核和呼吸雜志.2006;29(1):3-8；LiuYetal.BMCInfectiousDiseases.2009;9:31.3.TaoLLetal.ChinMedJ(Engl).2012;125(17):2967-2972.5可編輯課件PPT成人病毒性肺炎發(fā)病率高，但長期被忽視每年新發(fā)病毒性肺炎約200萬例，其中成人和兒童各100萬例10項成年人CAP綜述（共2910例），病毒性肺炎占22%JenningsLC,etal.Thorax2008;

63:42-8.RuuskanenO.Lancet2011;377:1264-75.6病毒科病毒種核酸類型正粘病毒科流感病毒單股RNA副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、人類偏肺病毒單股RNA披膜病毒科風疹病毒單股RNA小RNA病毒科鼻病毒、柯薩奇病毒和?？刹《镜牟糠中蛣e單股RNA腺病毒科腺病毒雙股DNA冠狀病毒科人類冠狀病毒、SARS冠狀病毒單股RNA皰疹病毒科單純皰疹病毒、帶狀皰疹、EB和CMV雙股DNA細小病毒科人類博卡病毒單鏈DNA呼腸孤病毒科呼腸孤病毒（1，2，3，4型）雙鏈RNA6可編輯課件PPTPathogenidentifiedPatientsn(%)RespiratoryViruses262(27.5)

InfluenzavirusA94(9.9)

Humanrhinovirus41(4.3)

Adenovirus40(4.2)

Humanmetapneumovirus17(1.8)

Parainfluenzavirustype116(1.7)

Parainfluenzavirustype314(1.5)

Parainfluenzavirustype211(1.2)

InfluenzavirusB6(0.6)

Humanenterovirus5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeA5(0.5)

RespiratorysyncytialvirustypeB4(0.4)

CoronavirusOC43/HKU14(0.4)

Coronavirus229E/NL634(0.4)

Parainfluenzavirustype41(0.1)Bocavirus0(0.0)北京市成人CAP監(jiān)測網：病毒性肺炎27.5%2010-2012年本課題組牽頭，聯合北京市12家醫(yī)院954例成人CAP患者中，病毒性肺炎占27.5%。重要病毒：流感病毒、鼻病毒、腺病毒、偏肺病毒和呼吸道合胞病毒。

JiuXinQu.BMCInfectDIs2015onlinefirst77可編輯課件PPT上呼吸道標本類型及適應癥88可編輯課件PPT上呼吸道感染標本的采集9

用拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁（3-5次）

咽拭子的采集方法9可編輯課件PPT咽拭子的采集正確拿咽拭子的方法錯誤拿咽拭子的方法上呼吸道感染標本的采集10可編輯課件PPT上呼吸道感染標本的采集11

請患者頭部保持不動，將拭子輕輕轉動緩緩插入患者鼻腔，不要用力，

當遇到阻力后即到達后鼻咽，停留數秒吸取分泌物，輕輕旋轉取出拭子鼻拭子標本的采集11可編輯課件PPT病毒：選用滌綸或人造棉頭塑料柄的拭子（如：聚丙烯纖維頭），不能用藻酸鈣及木柄拭子，可使病毒失活或抑制PCR反應。脫脂棉拭子含有熒光物質，影響熒光定量PCR結果細菌：選用藻酸鈣拭子。棉拭子、尼龍拭子可抑制百日咳博德特菌生長采樣后用于病毒檢測的拭子，將拭子頭浸入含一定量采樣液的螺口管中，尾部棄去，旋緊管蓋，及時送檢，如不能立即送檢，可暫時儲存于4℃冰箱內，嚴禁-20℃冷凍。用于細菌檢測的拭子插回采樣管中或適宜的轉運裝置中，立即送檢12上呼吸道感染標本的采集支原體保存液病毒采樣拭子細菌采樣拭子12可編輯課件PPT下呼吸道標本類型及適應癥1313可編輯課件PPT下呼吸道標本類型及適應癥14下呼吸道標本中，痰&支氣管鏡標本最為重要！14可編輯課件PPTFukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534標本的質量15可編輯課件PPT標本的質量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:53416可編輯課件PPT標本的質量Fukuyamaetal.BMCInfectiousDiseases2014,14:534Inconclusion,sputumGramstainishighlyspecificfortheetiologicdiagnosisofCAPandHCAPandusefulinguidingpathogen-targetedantibiotictreatment17可編輯課件PPT病例1男性，64歲既往史：心肌梗死2次嚴重的充血性心力衰竭，行雙側冠狀動脈旁路移植手術心臟移植（植入式心臟復律除顫器）癥狀：呼吸困難、干咳、低熱初步診斷：支氣管肺泡灌洗：無致病菌，

正常菌群（真菌和分枝桿菌）胸片：右下肺局限性密度影肺癌？SeifertH.CID,2009,48:S238-4518可編輯課件PPT手術，抗菌藥物患者治愈血培養(yǎng)：初次：類白喉桿菌（皮膚污染）第二次：馬紅球菌（免疫缺陷宿主的條件致病菌）最終診斷：細菌性肺炎治療：紅霉素，3個月，治愈微生物結果—條件致病菌感染診斷關鍵肺內腫塊基本吸收SeifertH.CID,2009,48:S238-4519可編輯課件PPT醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）的微生物標本采集和送檢要求病原檢驗項目最優(yōu)標本轉運要求；送檢最佳時間銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌屬、粘質沙雷菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、金黃色葡萄球菌和MRSA、流感嗜血桿菌血培養(yǎng)血培養(yǎng)已經注入標本的培養(yǎng)瓶室溫下盡快送抵實驗室。革蘭染色定量或半定量需氧和厭氧細菌培養(yǎng)痰；支氣管抽吸物；支氣管肺泡灌洗液；PSB；肺組織無菌杯或管，室溫，2h肺炎鏈球菌同上尿液無菌容器，室溫，2h混合厭氧菌（吸入）革蘭染色培養(yǎng)PSB標本肺組織無菌管；無菌容器放組織；室溫，2h曲霉菌屬真菌涂片或其他真菌染色方法支氣管抽吸物無菌杯或管，室溫，2h真菌培養(yǎng)支氣管肺泡灌洗液；PSB半乳甘露聚糖（GM）1-3β-D葡聚糖（G）血清支氣管肺泡灌洗液促凝管，室溫，立即送檢無菌杯或管，室溫，2h20可編輯課件PPT老年CAP患者的病原學診斷2011年ERS/ESCMD指南建議所有住院患者均應進行血培養(yǎng)北美指南建議對更嚴重的患者進行血培養(yǎng)血培養(yǎng)有助于確診潛在的肺炎病原體和根據分離病原菌對疾病進行重新評估血培養(yǎng)染色法呼吸樣本培養(yǎng)尿抗原檢測對初始抗生素治療方案調整具有重要的影響作用但同樣的呼吸道標本缺乏較高的預測老年患者存在功能障礙：無法獲得可評價的痰液；口咽定植的G-菌、金黃色葡萄球菌和MDR菌較多肺炎鏈球菌和嗜肺軍團菌的細菌抗原采用尿免疫層析技術檢測肺炎鏈球菌抗原的敏感性約大于60%，成人患者大于90%軍團菌抗原檢測的敏感性大于90%老年CAP患者的病原學診斷方法González-CastilloJ,etal.RevEspQuimioter.2014;27(1)：69-8621可編輯課件PPT22指南中強調：血培養(yǎng)至少送2套

在發(fā)熱開始的24h內進行血培養(yǎng)。盡力保證在抗感染治療前獲得首份血培養(yǎng)標本。同時經2個獨立部位抽取血標本，此結果比單一部位的血培養(yǎng)更有臨床意義。除外新生兒外，不建議只進行單套血培養(yǎng)（Ⅱ級）。48-96h后評估治療效果，再次血培養(yǎng)不能單取1套，必須同時抽取2套標本（Ⅱ級）。但對懷疑血管內的感染，則應該間隔一段時間取不同部位的靜脈穿刺抽血，有助于診斷持續(xù)性菌血癥（Ⅱ級）。CritCareMed2008Vol.36,No.4；CLSI指南；英國指南22可編輯課件PPT23“雙抽四瓶”，每瓶8-10ml

標示“左側”、“右側”

無菌體液

如胸水等手冊宣講23可編輯課件PPT痰標本在病原學診斷中面臨的困難CAP患者40%以上患者無法或及時產生痰痰標本合格率較低，甚至送檢唾液培養(yǎng)：痰培養(yǎng)陽性率受多種影響因素影響且影響極大，包括標本采集、運輸、快速處理、合理應用細胞學判斷標準、前期無抗生素治療、解釋技能涂片革蘭染色：最新數據表明，通過革蘭染色辨別1669個CAP住院病人合格標本，只有14%可以辨別出主要形態(tài)類型24AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)24可編輯課件PPT痰標本不同外觀25唾液膿痰粘液樣痰帶血痰25可編輯課件PPT26標本質量評估－痰涂片Garbagein！唾液26可編輯課件PPT一個小調查隨機調查中國15家醫(yī)院2014年痰標本數據2727可編輯課件PPT痰標本判讀標準的比較2828可編輯課件PPT合格痰標本：吞噬很重要29WBC內吞噬：葡萄球菌29可編輯課件PPT涂片項目報告格式30普通細菌涂片及染色30可編輯課件PPT

痰培養(yǎng)標本質量情況

總數不合格不合格率兒科9777.78%內科2620188371.87%急診64444168.48%血液科1501102067.95%外科39726767.25%婦產科231356.52%門診26715056.18%ICU121555745.84%

13家醫(yī)院，痰標本合格率不足50%31可編輯課件PPT粒缺患者肺炎的致病菌CurrOpinPulmMed2015,21:260–27132可編輯課件PPT對于確診IA：GM的診斷效能CurrOpinPulmMed2015,21:260–27133可編輯課件PPT粒缺腫瘤肺炎：微生物學評價BAL是很好的診斷工具CurrOpinPulmMed2015,21:260–27134可編輯課件PPT惡性粒細胞減少患者的肺炎診斷臨床評估+微生物學評估+分子微生物學評估：①最可靠：從無菌部位分離or呼吸道分泌物中非共生菌②BAL是首選下呼吸道標本，越早采集越好，尤其使用抗生素之前，但不能延誤治療③支氣管活檢（TBBX）可揭示侵入血流感染，但培養(yǎng)不優(yōu)于BAL，且因為惡性粒細胞減少繼發(fā)血小板減少使得并發(fā)癥風險高④分子方法：半乳甘露聚糖分子試驗測試侵襲性曲霉?。‵DA已經批準）ScottE.EvansandDavidE.Ost,Pneumoniaintheneutropeniccancerpatient,Infectiousdiseases,2015,21(3):261-27135可編輯課件PPT日均痰標本與BAL送檢對比3636可編輯課件PPTBAL標本量要求生理鹽水總灌入量不少于100ml，分3-5份進行（標準為200-240ml，分4等份進行）好的BAL標本，至少30%灌入液回收<30%回收率的被視作不合格，需要重新采集（尤其是<10%回收率的標本）MeyerKC,AnofficialAmericanThoracicSocietyclinicalpracticeguideline:theclinicalutilityofbronchoalveolarlavagecellularanalysisininterstitiallungdisease,AmJRespirCritCareMed.2012May1;185(9):1004-1437可編輯課件PPT肺泡灌洗液標本的優(yōu)點BALF標本培養(yǎng)的陽性率高，合格率高BALF的采集不需要患者的配合【1】BALF能避免上呼吸道的定植菌的污染，減少對培養(yǎng)結果判斷的干擾。381.AmericanThoracicSociety,InfectiousDiseasesSocietyofAmerica.GuidelinesontheManagementofCommunity-AcquiredPneumoniainAdults,2007:44(Suppl2)38可編輯課件PPT肺泡灌洗液標本的處理39將所有標本裝入50ml離心管內漩渦震蕩30-60s每個平板定量涂10μLUsepipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀釋）生長出>10個菌落培養(yǎng)后菌落計數：相同形態(tài)菌落數×103CFU/mL

制作涂片（細胞離心)血平皿巧克力平皿麥康凱平皿若用接種環(huán)密涂平板，生長的菌落數量會低于實際數量。但用L棒涂布平板計數，定量培養(yǎng)結果更準確39可編輯課件PPT肺泡灌洗液的涂片革蘭染色適量BALF標本進行細胞離心，經自然干燥、甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色標本質量判斷以扁平鱗狀上皮細胞占全部細胞比例<1%為合格標本敏感度為104個細胞/mL，若每個油鏡視野可見1個或多個細菌，報告革蘭染色形態(tài)及白細胞結果，提示此菌與活動性肺炎相關。40PatrickRM.Manualofclinicalmicrobiology.9thed.US:ASMPress,2007:307-308中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準——下呼吸道感染細菌培養(yǎng)操作規(guī)范[S].40可編輯課件PPT肺泡灌洗液定量培養(yǎng)的意義細菌性感染，濃度閾值104CFU/mL，低于閾值濃度時，定植可能性大;高于閾值時，感染可能性大。真菌性感染，目前沒有BAL的診斷性閾值。絲狀真菌也沒有閾值。但絲狀真菌在呼吸道分泌物中的價值遠大于酵母菌屬。該類菌在EORTC/MSG指南中有“臨床診斷(probablediagnosis)”價值411.AGuidetoUtilizationoftheMicrobiologyLaboratoryforDiagnosisofInfectiousDiseases:2013RecommendationsbytheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica(IDSA)andtheAmericanSocietyforMicrobiology(ASM),2013:57(15August)2.EORTC/MSG41可編輯課件PPT培養(yǎng)與涂片結果不符：重新讀片中華結核和呼吸雜志,2011,34(9)42可編輯課件PPT哮喘患者：結晶和庫什曼螺旋體43可編輯課件PPT有意義的細菌濃度值（CFU/ml）標本有意義的濃度CFU/ml自然咳痰107誘導痰不確定氣管內吸取物106支氣管肺泡灌洗液104保護性毛刷103支氣管灌洗液不做培養(yǎng)44可編輯課件PPTFilmArrayRespiratoryPanel第一個用單個標本同時檢測病毒和細菌性呼吸道感染的測試2min上機時間，1h周轉時間300μl樣本（鼻咽拭子即可）/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm304177.htm/the-panels/45可編輯課件PPT征集：最想對呼吸科大夫說的話留取痰培養(yǎng)后，能否先肉眼評估一下標本質量送檢痰培養(yǎng)的目的是什么？微生物檢驗報告您參考嗎？何時參考？少送痰！多采血！我們盡全力幫您找破案證據（病原菌），前提是您提供一個好的案發(fā)現場（合格標本）當您面對感染病人時，微生物室與您零距離！不要忘了病毒不要用了抗生素之后，才想起送培養(yǎng)4646可編輯課件PPT47可編輯課件PPT藥敏報告共識概要藥敏試驗的意義和基本原則具體的專業(yè)要求特殊耐藥性和耐藥表型的審核要點報告形式48可編輯課件PPT藥敏試驗的基本原則

藥敏試驗的前提條件實驗室的人員能力和客觀條件檢測環(huán)節(jié)的規(guī)范標準，結果可信具有解釋結果的能力，能提供臨床會診分離株應有臨床意義檢測結果應準確遵照CLSI文件質控符合要求