免疫組織化學(xué)報(bào)告人：傅琦博指點(diǎn)教師：胡翊群傅琦博F0318102何謂免疫組化免疫組織化學(xué)是指在組織細(xì)胞原位經(jīng)過抗原抗體反響和組織呈色反響，借助可見的標(biāo)志物，對相應(yīng)的抗原或抗體進(jìn)展定位、定性和定量檢測的一種免疫檢測方法。傅琦博F0318102免疫組化的全過程抗原的提取與純化免疫動物或細(xì)胞交融，制備特異性抗體及純化標(biāo)志物與抗體集合構(gòu)成標(biāo)志抗體標(biāo)本的處置抗原抗體反響和呈色反響顯微鏡下察看結(jié)果傅琦博F0318102組織抗原抗體標(biāo)志物

標(biāo)志抗體1熒光2酶3親和技術(shù)4金標(biāo)傅琦博F0318102組織抗原免疫細(xì)胞化學(xué)反響原理：＋標(biāo)志抗體標(biāo)志的抗原抗體復(fù)合物傅琦博F0318102間接法直接法兩種免疫細(xì)胞化學(xué)反響方法傅琦博F0318102標(biāo)本的處置標(biāo)本的主要來源：活體組織、各種體液、穿刺液、培育細(xì)胞標(biāo)本的固定與保管酶消化處置組織資料處置是獲得良好免疫細(xì)胞組織化學(xué)分析的保證，必需保證要檢測的細(xì)胞或組織取材新穎、固定即使及時、形狀保管良好、抗原物質(zhì)的抗原性不被破壞。傅琦博F0318102標(biāo)本的固定與保管固定的目的：是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止胞內(nèi)酶活化反響，防止細(xì)胞自溶，堅(jiān)持細(xì)胞固有形狀與構(gòu)造，防止細(xì)胞零落，去除干擾抗原抗體反響的類脂，最主要的是保管組織細(xì)胞的抗原性，在染色和反復(fù)清洗的過程中使抗原不致釋放。好的固定劑：〔1〕能快速固定抗原〔2〕防止抗原物質(zhì)分散〔3〕固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反響傅琦博F0318102標(biāo)本的固定與保管抗原固定劑固定溫度與時間蛋白質(zhì)95％乙醇室溫，3～15min免疫球蛋白丙酮4℃，30min酶四氯化磺4℃，30min激素1％聚甲醛4℃，4～5h細(xì)菌丙酮、甲醇室溫，3～10min病毒丙酮，無水乙醇室溫，5～10min四氯化磺4℃，30～60min類脂質(zhì)10％甲醛室溫，3～10min細(xì)胞懸液1％聚甲醛室溫，2min各種抗原的固定傅琦博F0318102標(biāo)本的固定與保管冰凍切片和石蠟切片時免疫組化中最常用的制片方法。冰凍切片制片方法簡單，可防止石蠟切片因固定、脫水、浸蠟等步驟呵斥的抗原損失。迅速冷凍可防止冰晶的構(gòu)成，防止組織細(xì)胞構(gòu)造的破壞。石蠟切片是察看組織細(xì)胞構(gòu)造的理想方法，可用于陳舊石蠟包埋資料的回想性免疫組化研討，切片薄，有延續(xù)性，蠟塊可長期保管，但是抗原的保管量不如冰凍切片。傅琦博F0318102酶消化處置石蠟包埋資料大都用甲醛固定保管，固定過程中由于醛鍵構(gòu)成致使某些抗原決議簇被封鎖，染色不理想，甚至出現(xiàn)假陰性，因此在進(jìn)展免疫組化反響之前，需求酶消化處置切片，可使抗原決議簇重新裸露。常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。傅琦博F0318102抗體處置與保管抗體是免疫組化技術(shù)的首要試劑，通常選用的高特異性、高效價(jià)的第一抗體為多克隆抗體?？贵w稀釋的原那么是陽性〔抗原〕物質(zhì)著色應(yīng)鮮明，背景應(yīng)錢或不著色?？贵w效價(jià)越高，孵育時間越長，方法越敏感抗體稀釋度應(yīng)越高。傅琦博F0318102免疫染色標(biāo)志抗體與標(biāo)本中抗原反響并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物；用緩沖液沖洗去未結(jié)合的成分；直接在顯微鏡下察看結(jié)果〔免疫熒光直接法〕，或待標(biāo)本顯色后再用顯微鏡察看結(jié)果〔免疫酶直接法〕免疫染色是免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟。傅琦博F0318102免疫染色對一些特殊的標(biāo)本需進(jìn)一步進(jìn)展處置來添加檢測的敏感性和特異性，減少非特異性干擾。1.蛋白酶消化法采用蛋白酶消化的目的是暴露抗原，添加細(xì)胞和組織的通透性，以利于抗體與抗原最大限制的結(jié)合。常用蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等。2.非特異吸附法免疫組化技術(shù)中非抗原抗體反響出現(xiàn)的陽性染色成為非特異性染色。防止非特異性染色的有效方法是采用與第二抗體一樣的動物源血清〔非免疫血清〕吸附封鎖底物煮至上的帶電荷物質(zhì)，然后再進(jìn)展抗原抗體結(jié)合反響，必要時也可采用2%左右的?；蛉税椎鞍追馄?，減少非特異性染色。傅琦博F0318102免疫組化染色中標(biāo)識物的選擇用量微小，容易在光鏡或電鏡下識別機(jī)體內(nèi)無同一物質(zhì)或類似物質(zhì)物理或化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可與抗原或抗體結(jié)合，其結(jié)合物也穩(wěn)定目前常用標(biāo)識物質(zhì)有熒光色素、放射性同位素、重金屬、微粒子、酶等傅琦博F0318102設(shè)立對照實(shí)驗(yàn)為確定結(jié)果的可靠性，在實(shí)驗(yàn)中必需設(shè)置對照。通常是針對第一抗體設(shè)立對照，包括陽性對照、陰性對照、替代對照、空白對照、本身對照和吸收實(shí)驗(yàn)等?！?〕陽性對照用不斷抗原陽性的切片與待測標(biāo)本同時進(jìn)展免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽性對照應(yīng)呈陽性結(jié)果，即為陽性對照。〔2〕陰性對照用不含不斷抗原的標(biāo)本作對照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性，即為陰性對照。陰性對照中還包括空白對照、替代對照、吸收和抑制對照等，用以排除假陽性結(jié)果。傅琦博F0318102免疫組化的結(jié)果判別染色特異性染色非特異性染色顯色部位特定細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)均勻染色或更強(qiáng)顯色定位特定，具有結(jié)構(gòu)性無特定部位，無結(jié)構(gòu)性顯色程度同一部位呈不同程度顯色無分布規(guī)律，某一片均勻著色免疫組織化學(xué)的結(jié)果判別應(yīng)非常嚴(yán)謹(jǐn)，陽性細(xì)胞的染色分布有三種類型：胞漿型、細(xì)胞核型和細(xì)胞膜外表型。陽性細(xì)胞顯色深淺可反映出抗原的濃度，并以此作為定性、定量和定位的根據(jù)。陽性細(xì)胞的染色常定位于細(xì)胞，并于陰性細(xì)胞間有明顯間隔，而非特異性染色常不限于單個細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞，兩者可由顯著區(qū)別。傅琦博F0318102幾種常用的免疫組化檢測技術(shù)熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)酶免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金〔銀〕組織化學(xué)技術(shù)免疫標(biāo)志電鏡技術(shù)……傅琦博F0318102免疫熒光技術(shù)將熒光素作為標(biāo)志物使組織細(xì)胞中構(gòu)成的抗原抗體復(fù)合物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示抗原物質(zhì)的定位

免疫熒光技術(shù)傅琦博F0318102１.異硫氰酸熒光素FITC２.四乙基羅達(dá)明３.四甲基異硫氰酸羅達(dá)明４.藻紅蛋白

▲呈現(xiàn)不同的熒光：綠色熒光(FITC)橙色熒光橙紅色熒光 紅色熒光等

熒光素作為染料在激發(fā)光照射下能產(chǎn)生熒光的一類化合物傅琦博F0318102

熒光：在激發(fā)光〔熒光顯微鏡提供〕的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光并隨照射停頓而消逝熒光顯微鏡：熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如紫外光、藍(lán)紫光〔有不同的波長范圍〕，使受檢標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出發(fā)射光傅琦博F0318102海馬細(xì)胞微管蛋白綠色(胞體、樹突)軸突終末蛋白紅色(突觸)傅琦博F0318102培育的成纖維細(xì)胞微管呈綠色核呈藍(lán)色傅琦博F0318102免疫組織化學(xué)技術(shù)的運(yùn)用熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于病原體感染的早期診斷，本身抗體檢測，分析淋巴細(xì)胞外表標(biāo)志物質(zhì)及抗原、抗體的免疫組化定位等；在病原生物學(xué)方面，主要用于菌種的堅(jiān)決和抗原構(gòu)造的分析；在細(xì)胞免疫學(xué)檢測中，用以檢測拎包細(xì)胞外表的各種CD抗原、免疫球蛋白受體、HLA抗原和各種膜受體等。酶免疫組織化學(xué)技術(shù)主要用于組織切片或其它抗原的定位檢測。組織切片中的各類抗原性物質(zhì)，如各類蛋白質(zhì)、酶、激素、細(xì)胞、病毒、腫瘤抗原、姜細(xì)胞中的免疫球蛋白、各種多肽、細(xì)胞外表標(biāo)志等均可檢測。免疫標(biāo)志電鏡技術(shù)由于需求電子顯微鏡，目前仍較多用于科研分析。傅琦博F0318102免疫組化在臨床病理診斷中的運(yùn)用標(biāo)志淋巴造血組織及其腫瘤的細(xì)胞來源和細(xì)胞分化程度;協(xié)助腫瘤良惡性的診斷;鑒別低分化癌和肉瘤;鑒別轉(zhuǎn)移癌的性質(zhì);協(xié)助發(fā)現(xiàn)骨髓、淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)移癌灶;鑒別小細(xì)胞惡性腫瘤;癌組