第十章

甾體激素類藥物的分析2/19/20241DABC123456789101112131415161718192021甾體激素類藥物是一類具有甾體結(jié)構(gòu)的激素類藥物，有非常重要的生理功能。分類(按藥理作用):甾體激素類藥物性激素腎上腺皮質(zhì)激素雌性激素雄性激素蛋白同化激素孕激素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有環(huán)戊烷并多氫菲母核。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、頻發(fā)性哮喘等腎上腺皮質(zhì)功能不全休克重癥肌無力甾A環(huán)、B環(huán)有一個(gè)或兩個(gè)雙鍵2/19/20242主要可供分析基團(tuán)：1.3-酮，C20酮基3.C17:2.C11：腎上腺皮質(zhì)激素(天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物)：氫化可的松醋酸地塞米松曲安西龍地塞米松磷酸鈉地塞米松磷酸鈉：增強(qiáng)水溶性氫化可的松：天然皮質(zhì)激素醋酸地塞米松：肌注延長作用時(shí)間2/19/20243雄性激素及蛋白同化激素(天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物)：雄性激素同時(shí)具有蛋白同化激素作用，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后，雄性激素作用減弱，同化作用保留或增強(qiáng)，成為蛋白同化激素。甲睪酮丙酸睪酮苯丙酸諾龍結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.3-酮基；2.C17：有羥基或酯基丙酸睪酮：C17酯化后延長作用時(shí)間蛋白同化激素雄性激素雄性激素：母核有19個(gè)碳原子蛋白同化激素：母核有18個(gè)碳原子C10一般無角甲基C17-羥基或它形成的酯2/19/20244孕激素(天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物)：天然孕激素為黃體酮，口服無效，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后得到口服有效及長效衍生物。醋酸甲地孕酮黃體酮結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.3-酮基；2.C17：有甲酮基有些藥物有羥基或酯基2/19/20245雌性激素(天然產(chǎn)物或天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物)：天然雌性激素為雌二醇，經(jīng)結(jié)構(gòu)改造得到高效及長效衍生物。炔雌醇雌二醇結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.A環(huán)為苯環(huán)2.3-酚羥基；3.C17：羥基有些藥物有羥基成酯，或有炔基2/19/20246幾種甾體激素類藥物結(jié)構(gòu)的比較：皮質(zhì)激素：有21個(gè)碳原子，C17-酮醇基，或該醇基形成的磷酸酯或磷酸酯的二鈉鹽雄性激素：母核有19個(gè)碳原子蛋白同化激素：母核有18個(gè)碳原子孕激素：：母核有21個(gè)碳原子C17-甲酮基雌性激素：母核有18個(gè)碳原子A環(huán)為苯環(huán)，C17上常有炔基同：C17-羥基或它形成的酯異：C10一般無角甲基2/19/20247鑒別試驗(yàn)制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)光譜法色譜法

呈色反應(yīng)：⊕與強(qiáng)酸反應(yīng)(維生素D：醋酐+硫酸)官能團(tuán)反應(yīng)化學(xué)鑒別法UVIRTLCHPLC2/19/20248甾體激素與硫酸、鹽酸、磷酸、高氯酸等強(qiáng)酸反應(yīng)呈色。藥品名稱顏色加水稀釋后醋酸可的松黃或微帶橙色顏色消失溶液澄清氫化可的松棕黃至紅色并顯綠色熒光黃至橙黃，微帶綠色熒光，有少量絮狀沉淀潑尼松橙色黃至藍(lán)綠醋酸潑尼松橙色黃至藍(lán)綠潑尼松龍深紅色紅色消失，有灰色絮狀沉淀醋酸潑尼松龍玫瑰紅色紅色消失，有灰色絮狀沉淀地塞米松磷酸鈉黃或紅棕色黃色絮狀沉淀炔雌醇橙紅色并顯黃綠色熒光玫瑰紅色絮狀沉淀炔雌醚橙紅色并顯黃綠色熒光紅色絮狀沉淀苯甲酸雌二醇黃綠色并顯藍(lán)色熒光淡橙色己酸羥孕酮微黃色由綠經(jīng)紅至帶藍(lán)熒光的紅紫色甾體激素與硫酸的呈色反應(yīng)操作簡便，不同藥物可形成不同的顏色或熒光而能相互區(qū)別，反應(yīng)靈敏，為各國藥典所應(yīng)用2/19/20249-醇酮基有還原性，可與堿性酒石酸酮試液(紅色Cu2O↓)，氨制硝酸銀試液(黑色Ag↓)，四氮唑試液反應(yīng)。氯化三苯四氮唑(TTC)深紅色還可用于皮質(zhì)激素類藥物雜質(zhì)檢查(TLC)時(shí)的顯色劑，皮質(zhì)激素類藥物的含量測(cè)定不同的甾體激素藥物有不同的官能團(tuán)，利用官能團(tuán)反應(yīng)可區(qū)別不同藥物。1、C17--醇酮基的呈色反應(yīng)——腎上腺皮質(zhì)激素類

2/19/2024102、酮基的呈色反應(yīng)C3和C20位的酮羰基可與羰基試劑(2,4-二硝基苯肼，硫酸苯肼，異煙肼等)反應(yīng)，生成黃色的腙而用于鑒別。如黃體酮的鑒別：取供試品約0.5mg，置小試管中，加異煙肼約1mg和甲醇1ml溶解后，顯黃色。3、甲酮基的呈色反應(yīng)

黃體酮與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)，顯藍(lán)紫色，可認(rèn)為是黃體酮的靈敏、專屬的鑒別反應(yīng)。其它分子結(jié)構(gòu)中含有甲酮基的甾體激素呈現(xiàn)淡橙色或不顯色。4、酚羥基的呈色反應(yīng)

雌激素的C3位上有酚羥基，可與重氮苯磺酸反應(yīng)生成紅色偶氮染料(JP：苯甲酸雌二醇)。5、炔基的沉淀反應(yīng)具有炔基的甾體激素藥物(炔雌醇、炔諾酮等)，遇硝酸銀試液，即生成白色的炔化銀沉淀。R-C≡CH+AgNO3→R-C≡CAg↓+HNO3還可用于含量測(cè)定2/19/2024116、鹵素的反應(yīng)對(duì)連接在C6,C9或其它位置上的氟或氯進(jìn)行確認(rèn)。(1)鹵素連接在母核的環(huán)上：需用氧瓶燃燒法破壞，使有機(jī)鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)鹵素離子，再進(jìn)行鑒別(如地塞米松磷酸鈉，丙酸倍氯米松)。(2)鹵素連接在側(cè)鏈上：可通過加熱水解方法產(chǎn)生鹵素離子，再進(jìn)行鑒別(如丙酸氯倍他索)。DABC697、酯的反應(yīng)有些本類藥物，在C17或C21位上連接有酯基，可將其水解，產(chǎn)生相應(yīng)的羧酸，再根據(jù)羧酸的性質(zhì)進(jìn)行鑒別(如醋酸潑尼松，己酸羥孕酮等)。DABC1721醋酸,在酸性條件下與乙醇生成醋酸乙酯，有香氣己酸，有特臭2/19/202412部分本類藥物用測(cè)定衍生物熔點(diǎn)的方法進(jìn)行鑒別1、縮氨基脲的生成C3位的羰基和氨基脲發(fā)生縮合，生成縮氨基脲，可測(cè)定其熔點(diǎn)，對(duì)藥物進(jìn)行鑒別。如苯丙酸諾龍，產(chǎn)物熔點(diǎn)約為182℃，熔融同時(shí)分解。2、酯的水解若結(jié)構(gòu)是有機(jī)酸的酯，可水解后測(cè)定產(chǎn)物熔點(diǎn)。如丙酸睪酮C17位是丙酸和睪酮形成的酯，堿性水解后得到睪酮，熔點(diǎn)應(yīng)為150~156℃。3、酯的生成某些藥物有羥基，可與酰鹵生成酯，可測(cè)定酯的熔點(diǎn)進(jìn)行鑒別。如炔雌醇C3位上的羥基與苯甲酰氯成酯后，熔點(diǎn)為200~202℃。4、酮肟的生成有些藥物C3位的羰基可與羥胺形成肟，可測(cè)定肟的熔點(diǎn)對(duì)藥物進(jìn)行鑒別。如黃體酮與鹽酸羥胺反應(yīng)后生成黃體酮雙肟，熔點(diǎn)為235~240℃。炔雌醇m.p.201℃黃體酮雙肟m.p.238℃2/19/202413UV：甾體激素類藥物有共軛結(jié)構(gòu)或有苯環(huán)，有紫外特征吸收，可規(guī)定其最大吸收波長max，max處的吸收度，或某兩個(gè)波長處吸收度的比值進(jìn)行鑒別(如中國藥典中丙酸倍氯米松的鑒別)。IR：對(duì)于本類藥物，幾乎所有藥物原料藥都采用IR進(jìn)行鑒別。2/19/202414TLC：多數(shù)甾體激素類藥物的制劑，部分原料藥常采用TLC法進(jìn)行鑒別。如丙酸睪酮注射液：供試品和對(duì)照品配制濃度一致。展開后，供試液主斑點(diǎn)的顏色和位置應(yīng)與對(duì)照液主斑點(diǎn)相同。HPLC：部分甾體激素類藥物用HPLC法測(cè)定含量，可同時(shí)進(jìn)行鑒別。要求在一定色譜條件下，供試品的保留時(shí)間與對(duì)照品的保留時(shí)間一致。2/19/202415特殊雜質(zhì)檢查甾體激素類藥物通常要做“其他甾體”檢查；根據(jù)藥物在生產(chǎn)和貯存過程中可能引入的雜質(zhì)，有的藥物還需做“游離磷酸鹽”、“硒”及有機(jī)溶劑殘留量檢查等。2/19/202416甾體激素藥物多由其它甾體化合物結(jié)構(gòu)改造而來，可能引入的雜質(zhì)有合成的原料，中間體，副產(chǎn)物，降解產(chǎn)物，異構(gòu)體等，其結(jié)構(gòu)一般未知，但具有甾體結(jié)構(gòu)，與藥物結(jié)構(gòu)類似。方法：TLC或HPLC法進(jìn)行檢查。其它甾體檢查2/19/202417TLC法：多數(shù)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)未知且與藥物結(jié)構(gòu)相似，用高低濃度對(duì)比法來檢查。例：醋酸氟輕松中“有關(guān)物質(zhì)”檢查：取本品，加三氯甲烷-甲醇（9：1）溶解并制成每1ml中約含3mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（9：1）稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照薄層色譜法（附錄ⅤB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（97：3）為展開劑，展開，晾干，在105℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于2個(gè)，其顏色與對(duì)照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。氫化可的松和雌二醇見課本p252展開劑：不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶劑；苯-無水乙醇；二氯甲烷-甲醇-水；三氯甲烷-甲醇等。顯色劑：堿性四氮唑藍(lán)試液；硫酸-乙醇(2:8；1:1；3:7)；20%硫酸；10%磷鉬酸-乙醇液2/19/202418HPLC法不少甾體激素藥物用HPLC法測(cè)定含量，一般可在相同條件下檢查其他甾體。方法為主成分自身對(duì)照法。以供試品溶液的稀溶液為對(duì)照液，將對(duì)照液主峰的面積作為參比，來控制藥物中雜質(zhì)的量。例：黃體酮中“有關(guān)物質(zhì)”檢查：取本品適量，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋制成每1ml中約含1mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照溶液10μl，注入液相色譜儀，調(diào)整檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的50%。再精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各10μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的1.5倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，不得多于1個(gè)。其峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的3/4。14.3時(shí)間(min)14.322.22/19/202419游離磷酸鹽對(duì)于地塞米松磷酸鈉，倍他米松磷酸鈉來說，二者都是在C21位上羥基與磷酸形成的磷酸酯二鈉鹽，在藥物的生產(chǎn)和貯存過程中可能引入磷酸鹽，因此，要對(duì)藥物中的游離磷酸鹽進(jìn)行檢查。例：地塞米松磷酸鈉中游離磷酸鹽檢查

精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml使溶解；另取標(biāo)準(zhǔn)磷酸鹽溶液［精密稱取經(jīng)105℃干燥2小時(shí)的磷酸二氫鉀0.35g，置100ml量瓶中，加硫酸溶液(3→10)10ml與水適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；臨用時(shí)再稀釋10倍］4.0ml，置另一25ml量瓶中，加水11ml；各精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液(取無水亞硫酸鈉5g、亞硫酸氫鈉94.3g與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，臨用時(shí)取此混合物1.5g加水10ml使溶解，必要時(shí)濾過)1ml，加水至刻度，搖勻，在20℃放置30～50分鐘。照紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA），在740nm的波長處測(cè)定吸光度。供試品溶液的吸光度不得大于對(duì)照溶液的吸光度。

原理：磷酸鹽在酸性條件下與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬酸銨，再被1-氨基-2－萘酚-4-磺酸溶液還原，所得磷鉬酸藍(lán)在740nm有最大吸收。比較供試液與對(duì)照液的吸收度控制藥物中游離磷酸鹽的量。2/19/202420硒的檢查醋酸氟輕松，醋酸地塞米松，醋酸曲安奈德等甾體激素在生產(chǎn)過程中用到二氧化硒脫氫。二氧化硒對(duì)人體有劇毒，故需檢查。原理：先將藥物用氧瓶燃燒法有機(jī)破壞后，使硒轉(zhuǎn)化為高價(jià)氧化物(SeO3)，以硝酸溶液吸收；再用鹽酸羥胺將Se6+還原為Se4+；在pH2.0條件下，與二氨基萘試液作用，生成4，5-苯并苯硒，被環(huán)己烷提取后，在378nm有最大吸收。規(guī)定：供試液的吸光度不得大于硒對(duì)照溶液的吸光度。醋酸氟輕松(0.01%)醋酸地塞米松(0.005%)醋酸曲安奈德(0.005%)。2/19/202421有機(jī)溶劑殘留量測(cè)定

在甾體激素類藥物合成過程中，用到的有機(jī)溶劑種類多，數(shù)量也多，故在部分品種中要測(cè)定有機(jī)溶劑殘留量。例：ChP中地塞米松磷酸鈉中甲醇和丙酮的檢查(GC法)取本品約0.16g，精密稱定，置10ml量瓶中，精密加0.1％(ml/ml)正丙醇(內(nèi)標(biāo)物質(zhì))溶液2ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另取甲醇約7.9mg與丙酮約79mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液與對(duì)照品溶液，照殘留溶劑測(cè)定法（附錄ⅧP），用高分子多孔小球色譜柱(按正丙酮計(jì)算的理論板數(shù)大于700)，在柱溫150℃測(cè)定。含量丙酮不得超過5.0%(g/g)，并不得出現(xiàn)甲醇峰。

2/19/2024221、HPLC法2、UV法3、比色法異煙肼比色法四氮唑比色法Kober反應(yīng)比色法含量測(cè)定2/19/202423HPLC法廣泛用于甾體激素類藥物原料和制劑的含量測(cè)定(占中國藥典收載原料和制劑總量的一半以上)。多采用反相HPLC法，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。例：醋酸潑尼松龍的含量測(cè)定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水(70:30)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為240nm。理論板數(shù)按醋酸潑尼松龍峰計(jì)算不低于3000，醋酸潑尼松龍峰和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。內(nèi)標(biāo)溶液的制備取醋酸氟輕松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。測(cè)定法取本品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.50mg的溶液；精密量取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取醋酸潑尼松龍對(duì)照品適量,精密稱定，同法測(cè)定。按內(nèi)標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。2/19/202424甾體激素藥物含量測(cè)定的色譜條件及方法：1、所用固定相均為C18柱，即ODS柱。十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)是應(yīng)用最廣泛的一種化學(xué)鍵合相，是非極性固定相，流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水的混合溶液，極性較大，屬反相色譜系統(tǒng)。2、流動(dòng)相一般為不同比例的甲醇-水或乙腈-水溶合溶液。3、不同甾體激素藥物一般以不同的物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)。2/19/202425UV法部分甾體激素類藥物原料和制劑的含量用UV法測(cè)定(約占中國藥典收載原料和制劑總量的1/4。例：醋酸甲羥孕酮片的含量測(cè)定取本品10片(10mg,250mg規(guī)格)、15片(4mg規(guī)格)或25片(2mg規(guī)格)，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于醋酸甲羥孕酮20mg)，置100ml量瓶中,加無水乙醇約60ml，振搖15分鐘使醋酸甲羥孕酮溶解，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置另一100ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA）在240nm的波長處測(cè)定吸光度，按C24H34O4的吸收系數(shù)（Ｅ1%1cm）為408計(jì)算，即得UV法由于快速，簡便，曾廣泛用于本類藥物的含量測(cè)定，但由于其專屬性不強(qiáng)，有些品種的測(cè)定已被HPLC法代替。如醋酸地塞米松片的含量測(cè)定。2/19/202426甾體激素類藥物C3或其它位置上的酮羰基在酸性條件下可與羰基試劑異煙肼縮合，生成黃色的異煙腙，在一定波長有最大吸收。異煙肼法原理：2/19/202427供試品溶液：取本品適量(約相當(dāng)于倍他米松20mg)，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻(必要時(shí)濾過)對(duì)照品溶液：另取倍他米松磷酸鈉對(duì)照品適量(約相當(dāng)于倍他米松20mg)，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋至每1ml中含倍他米松0.4mg的溶液。精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1ml，分別置25ml量瓶中，各精密加異煙肼溶液(異煙肼75mg，鹽酸0.1ml，加甲醇溶解并稀釋至100ml)20ml，搖勻，置60℃水浴中保溫1小時(shí)，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法(附錄ⅣA)，在420nm的波長處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。例：異煙肼法測(cè)定倍他米松磷酸鈉的含量2/19/202428腎上腺皮質(zhì)激素類藥物的C17-醇酮基有還原性，強(qiáng)堿性條件下可以還原四氮唑?yàn)橛猩衔?，通過測(cè)定該有色化合物最大吸收處的吸收度，來對(duì)藥物含量進(jìn)行測(cè)定。四氮唑鹽有兩類：氯化三苯四氮唑(ChP)，藍(lán)四氮唑(USP)。氯化三苯四氮唑(TTC)深紅色四氮唑法原理：2/19/202429供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于醋酸氫化可的松20mg），置200ml量瓶中，加無水乙醇適量，使醋酸氫化可的松溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；對(duì)照品溶液：另取醋酸氫化可的松對(duì)照品約20mg，精密稱定，置200ml量瓶中，加無水乙醇適量，使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各1ml,分別置干燥具塞試管中,各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液1ml，搖勻,再各精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40～45分鐘，照紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA），在485nm的波長處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。例：四氮唑法測(cè)定醋酸氫化可的松片的含量2/19/202430

(1)藥物結(jié)構(gòu)：C11位是酮基的甾體比是羥基的反應(yīng)速度快；C21位是羥基的甾體比其酯化后反應(yīng)速度快，若酯是三甲基醋酸酯，磷酸酯或琥珀酸酯，速度更慢。(2)溶劑和水分：水分多會(huì)使呈色速度減慢，醛使吸收度增高，故溶劑用無水無醛乙醇為好。(3)堿的種類及加入順序：氫氧化四甲基銨最常用。先加四氮唑鹽再加堿液以防藥物分解。(4)空氣中氧及光線：反應(yīng)及產(chǎn)物對(duì)光及氧敏感，故需避光，暗處顯色，并在達(dá)到最大呈色后，立即測(cè)定吸收度。(5)溫度與時(shí)間：中國藥典的條件是在25℃的暗處反應(yīng)40~45min，以保證結(jié)果重現(xiàn)性。

四氮唑法廣泛用于皮質(zhì)激素類藥物的含量測(cè)定，但下述因素對(duì)有色產(chǎn)物的生成速度、呈色強(qiáng)度和穩(wěn)定性有影響：四氮唑法的影響因素:氫化可的松2/19/202431例：復(fù)方炔諾孕酮滴丸中炔雌醇的含量測(cè)定取本品10丸，除去包衣后，置20ml量瓶中，加乙醇約12ml，微溫使溶散后，放冷，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，另取炔諾孕酮與炔雌醇對(duì)照品適量，精密稱定，用乙腈溶解并定量稀釋制成每1ml中約含炔諾孕酮0.15mg與炔雌醇15

g的溶液作為對(duì)照品溶液。炔雌醇精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液各2ml，分置具塞錐形瓶中，于冰浴中冷卻30秒鐘后，各精密加硫酸－乙醇(4:1)8ml（速度必須一致），隨加隨振搖，加完后繼續(xù)冷卻30秒鐘，取出，在室溫放置20分鐘，照紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA），在530nm的波長處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得。用于雌激素的比色法測(cè)定。雌激素與硫酸-乙醇反應(yīng)呈色，