ICS01.040.65CCSB15/19T/SPPHN湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SPPHN004-2023番茄抗番茄褐色皺紋果病毒病鑒定技術(shù)規(guī)程Ruleforevaluationoftomatoresistancetotomatobrownrugosefruitvirusdisease2023-11-20發(fā)布 2023-11-20實(shí)施湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì) 發(fā)布T/SPPHN004-2023T/SPPHN004-2023II前 言本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第一部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求編制而成。本文件由湖南省植物保護(hù)研究所提出。本文件由湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位為湖南省植物保護(hù)研究所、湖南省蔬菜研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、寧波大學(xué)。T/SPPHN004-2023T/SPPHN004-2023PAGEPAGE1番茄抗番茄褐色皺紋果病毒病鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于番茄（SolanumlycopersicumL.）雜交種、自交系、群體和野生番茄資源等抗番茄番茄褐色皺紋果病毒病的室內(nèi)鑒定及抗性評(píng)價(jià)。規(guī)范性引用文件NY/T1858.7《番茄抗煙草花葉病毒病鑒定技術(shù)規(guī)程》術(shù)語(yǔ)和定義NY/T1858.7界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。TomatobrownringerfruitvirusToBRFV番茄褐色皺紋果病毒屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬/TomatobrownringerfruitvirusdiseaseToBRFVAgrobacterium-mediatedinfectiouscDNAclonesofToBRFVDNATi-質(zhì)粒重組體形成的、對(duì)寄主植物具有高效侵染能力的農(nóng)桿菌菌株，侵潤(rùn)寄主葉片后，能導(dǎo)致寄主植物發(fā)生原病原物的病害。試劑與耗材MS培養(yǎng)基該培養(yǎng)基包含MS培養(yǎng)基配方中的所有成分，但不含瓊脂和蔗糖；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也要根據(jù)需要自行添加。MS液體培養(yǎng)基MS干粉4.43g，蔗糖30g，無(wú)離子水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為5.8，于121℃高壓滅菌30min，4℃下保存?zhèn)溆谩S固體培養(yǎng)基MS干粉4.43g，蔗糖30g，瓊脂粉9g，無(wú)離子水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為5.8，于121℃高壓滅菌30min，4℃下保存?zhèn)溆?。YEP培養(yǎng)基YEP液體培養(yǎng)基胰蛋白胨 10g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，無(wú)離子水950mL，用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH7.0，定容至1000mL，于121℃高壓滅菌30min，4℃下保存?zhèn)溆谩EP固體培養(yǎng)基胰蛋白胨 酵母提取物氯化鈉瓊脂粉無(wú)離子水用5mol/LNaOH溶液調(diào)pH7.0，定容至1000mL，于121℃高壓滅菌30min，4℃下保存?zhèn)溆谩？股啬敢?0mg/mL卡那霉素母液250mg卡那霉素放入5ml無(wú)離子水中，溶解后在超凈臺(tái)內(nèi)注入5ml的一次性注射器中，經(jīng)孔徑0.22μm50mg/mL5個(gè)滅菌的2mL2℃～8℃箱中保存，可使用一個(gè)月；或-20℃長(zhǎng)期保存。50mg/mL利福平母液250mg0.22um濾膜過(guò)濾除菌，即配成50mg/mL利福平母液。分裝到5個(gè)滅菌的2mL冷凍管里，每管1mL，置-20℃可保存3個(gè)月。100mmol/L乙酰丁香酮母液98.1mg乙酰丁香酮先溶于少量無(wú)水甲醇中，再慢慢用無(wú)離子水定容至5ml，然后在超凈臺(tái)內(nèi)用一次性注射器和一次性0.22um濾膜過(guò)濾除菌，即配成100mmol/L乙酰丁香酮母液，分裝到5個(gè)滅菌的2mL冷凍管里，每管1mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配，置-20℃保存僅1個(gè)月。500mg/mL頭孢噻肟母液3g頭孢噻肟鈉先溶于6mL0.22um濾膜過(guò)濾500mg/mL6個(gè)滅菌的2mL1mLd。ToBRFV侵染性克隆農(nóng)桿菌菌株提取ToBRFV樣本基因組總PCR耗材MS干粉、蔗糖，瓊脂粉，無(wú)離子水、卡那霉素(Kanamyein)、利福平（Rifampicin）、乙酰丁香酮（Acetosyringone）、頭孢噻肟（Cefotaxime）、次氯酸鈉（NaClO）、一次性注射器、濾膜、移液器、儀器與設(shè)備抗病性鑒定設(shè)計(jì)小區(qū)排列鑒定番茄材料隨機(jī)排列或順序排列，每份鑒定材料重復(fù)3次，每一重復(fù)10株苗。對(duì)照品種設(shè)湖南省蔬菜研究所番茄品系21F433D1Solanumlycopersicumline21F433D1)或20B566D1(Soanumycoperscumne2056D1one-makerSoanmycoperscumc.moneymaker)為感病對(duì)照品種。種子消毒鑒定番茄種子經(jīng)滅菌水浸泡12h后，再依次經(jīng)70%酒精表面消毒30s、20%次氯酸鈉溶液（含0.1%Tween-20）浸泡15min，最后用滅菌水沖洗5~6次，即可催芽播種?？共⌒越臃N鑒定番茄育苗6.3（2113430n。22~2518~20℃，所有幼苗應(yīng)生長(zhǎng)健壯、3~4片真葉充分展開時(shí)，進(jìn)行抗病性鑒定。摩擦接種ToBRFV0.11mLPSBoC保存可用一周。采用摩擦接種法，4-534100uL病毒接種溫室侵染性克隆農(nóng)桿菌接種鑒定ToBRFVToBRFV侵染性克隆農(nóng)桿菌菌株，將凍存的ToBRFV侵染性克隆農(nóng)桿菌菌株接種至含卡那霉素100mg/L和利福平50mg/LYEP24h~48YEPOD6000.8~2.01mL4葉的背面。接種后的番茄植株置于溫室里，進(jìn)行正常的肥水管理。病情調(diào)查調(diào)查時(shí)間3d2日調(diào)查一次感病對(duì)照番茄品種的發(fā)病情況，一旦病情指數(shù)達(dá)到感病數(shù)值時(shí)（7d~15d），即對(duì)所有待鑒定番茄材料進(jìn)行病情調(diào)查。病情級(jí)別劃分接種植株的病情級(jí)別及其相對(duì)應(yīng)的癥狀描述見(jiàn)表1。表1 引起的番茄黃化曲葉病毒病的病情級(jí)別劃分病情級(jí)別癥 狀 描 述0無(wú)可見(jiàn)癥狀。1新葉明脈，有輕微花葉。3畸形、皺縮葉片占全株30%，植株輕微變矮。4花葉嚴(yán)重，葉片80%皺縮到整株壞死。調(diào)查方法病情指數(shù)（DI）按下列公式計(jì)算：∑（s×n）DI=——————— ×100% (1)N×S式中：DI——病情指數(shù)；∑——各病情級(jí)別代表數(shù)值與相對(duì)應(yīng)的各病情級(jí)別植株數(shù)乘積的總和；s——各病情級(jí)別的代表數(shù)值；n——各病情級(jí)別的植株數(shù)；N——調(diào)查總植株數(shù)；S——最高病情級(jí)別的代表數(shù)值?？共⌒栽u(píng)價(jià)抗病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情指數(shù)（DI）抗病性評(píng)價(jià)0%≤DI＜15%高抗Highlyresistant（病情指數(shù)（DI）抗病性評(píng)價(jià)0%≤DI＜15%高抗Highlyresistant（HR）10%≤DI＜30%抗病Resistant（R）30%≤DI＜55%中抗Moderatelyresistant（MR）55%≤DI＜77%感病Susceptible（S）77%≤DI≤100%高感Highlysusceptible（HS）鑒定有效性判別當(dāng)感病對(duì)照材料達(dá)到其相應(yīng)感病程度（DI≥55%），該批次鑒定視為有效。鑒定記載表格番茄材料抗番茄褐色皺紋果病毒病鑒定結(jié)果記載表（表3）。表3 年番茄材料抗褐色皺紋果病毒病鑒定結(jié)果記載表番茄材料編號(hào)名稱來(lái)源重復(fù)區(qū)號(hào)病情級(jí)別（株數(shù)）病級(jí)指數(shù)%平均病指%抗病性評(píng)價(jià)0級(jí)1級(jí)2級(jí)3級(jí)4級(jí)ⅠⅡⅢ注1．鑒定地點(diǎn)： 播種日期：3．摩擦接種日期： 調(diào)查日期：鑒定技術(shù)負(fù)責(zé)人（簽字）：鑒定材料處理鑒定完畢后，將人工病圃中所有的番茄植株及殘?bào)w集中焚燒。附錄A（資料性附錄）番茄褐色皺紋果病毒病病原學(xué)名和理化特性學(xué)名番茄褐色皺紋果病毒病的病原為番茄褐色皺紋病毒（Tomatobrownringerfruitvirus，ToBRFV），屬于帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobumovirus），是一種正單鏈RNA植物