目錄28508摘要 145811引言 2125552材料與方法 228282.1材料 2132182.2方法 3161982.2.1動物分組、造模及給藥 3206302.2.2檢測樣本收集 3293422.2.3檢測指標 3293222.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計 3186663結(jié)果與討論 4273443.1造模藥物劑量及動物初始體重選擇 4245073.2一般狀態(tài)觀察 4215263.3各組大鼠死亡情況 453462.5各組大鼠血清生化指標 6295302.6大鼠24h尿蛋白測定 7179304結(jié)論 720890參考文獻 831291致謝 9摘要目的：為研究趕黃草總黃酮對阿霉素腎病綜合征模型大鼠的保護作用。方法：

文以趕黃草總黃酮為原料，通過阿霉素誘導(dǎo)大鼠建立腎病綜合征模型。以24h尿蛋白定量、體質(zhì)量、各臟器指數(shù)、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）含量以及腎組織病理變化等為檢測指標，探索趕黃草總黃酮對腎病綜合征大鼠的影響。結(jié)果：阿霉素造?？倓┝繛?mg/kg，分別于第1d和第8d給藥，21d即造模成功。藥物干預(yù)4w后，同模型組相比,趕黃草總黃酮高劑量組大鼠TP增加了9.86%，TC降低了36.98%，TG降低了30.77%，大鼠24h尿蛋白量水平降低了70.84%?？傸S酮低劑量組TP增加了11.86%，TG降低了19.79%，大鼠24h尿蛋白量水平降低了57.98%，腎臟纖維化和損傷均有明顯改善。結(jié)論：

趕黃草總黃酮能夠調(diào)節(jié)腎病綜合征模型大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝，改善腎臟對蛋白的濾過，對腎病綜合征大鼠腎損傷具有一定的保護作用。關(guān)鍵詞：趕黃草；總黃酮；腎病綜合征；阿霉素1引言慢性腎臟病（CKD）是嚴重危害人類健康的常見疾病，世界上約11%的人患有該病，它是導(dǎo)致人類死亡的十大疾病之一。腎病綜合征是CKD臨床診斷的常見類型，占腎活檢病例的40%左右。腎病綜合SH征（nephroticsyndrome，NS）是由感染、遺傳、免疫等原因?qū)е履I小球濾過膜損傷，腎小球基膜通透性增加的一種病理生理狀態(tài)，其臨床典型的癥狀為大量蛋白尿（大于3.5g/24h）、低蛋白血癥（小于30g/L）、高度水腫及高脂血癥。腎病綜合征若得不到有效控制，將導(dǎo)致腎組織進行性纖維化，繼而逐漸發(fā)展至終末期腎病。趕黃草是虎耳草科扯根菜屬植物扯根菜Penthorumchinensepursh.的干燥地上部分，為苗族民間草藥，主產(chǎn)于四川、貴州、湖南等地，為四川瀘州古藺道地藥材。趕黃草性平、味苦、微辛、無毒、歸肝、腎經(jīng)。具有清熱解毒、退黃化濕、活血散瘀、利水消腫之功效，主治黃疸、經(jīng)閉、水腫、跌打損傷等。趕黃草歸肝經(jīng)，對肝病具有治療作用，趕黃草在苗族民間有上千年的用藥史，為苗族人民治療肝病，發(fā)揮出了獨特療效，被譽為“神仙草”。現(xiàn)代臨床也廣泛用于治療各型肝炎、膽囊炎、脂肪肝等。高度水腫是腎病綜合征臨床典型表現(xiàn)之一，趕黃草歸腎經(jīng)，主治水腫，而黃酮類化合物是趕黃草的主要化學(xué)成分，也是其功效成分，因此我們認為趕黃草總黃酮可能具有治療腎病綜合征的作用。前期我們已制備了含量超過50%的趕黃草總黃酮，本試驗通過建立腎病綜合征大鼠模型，研究趕黃草總黃酮對腎病綜合征大鼠的作用，為趕黃草總黃酮進一步研發(fā)和臨床治療腎病綜合征奠定基礎(chǔ)。2材料與方法2.1材料雄性SD大鼠，無特定病原體（SPF級），體重在160~200g左右，西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2018-17；注射用鹽酸阿霉素（ADR），山西普德藥業(yè)股份有限公司（批號02180802）；醋酸潑尼松片5mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司（批號170244）；趕黃草總黃酮（總黃酮含量為53.29%）；腦脊液與尿蛋白（CSF）測定試劑盒（終點法），北京利德曼生化股份有限公司（生產(chǎn)許可證號20000439）。Infinite200Pro酶標儀，上海吉盛醫(yī)學(xué)科技有限公司；Konelabprime30，Thermoscientific生化自動分析儀，芬蘭；CX40系列生物顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司。2.2方法2.2.1動物分組、造模及給藥取雄性SD大鼠60只，8只作為空白對照組，其余52只隨機分成4組，分別為模型組、醋酸潑尼松組及趕黃草總黃酮高、低劑量組，飼養(yǎng)一段時間，待體重達到250g以上放入清潔代謝籠中，禁食不禁水，收集24h尿液，將阿霉素用生理鹽水配成2mg/mL溶液。造模第1d和第8d除空白組外其余4組尾靜脈（iv）分別給予4mg/kg和1mg/kg劑量的阿霉素，空白對照組尾iv等體積的生理鹽水。隔一周收集一次24h尿液，送西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科測定尿蛋白含量，當24h尿蛋白含量達到100mg以上即表明腎病模型造模成功，模型制備成功后開始藥物干預(yù)，醋酸潑尼松組大鼠每天按劑量6mg/kg灌胃醋酸潑尼松1次，趕黃草總黃酮的成人劑量為0.016~0.032g/(kg.d），按成人與大鼠用藥量換算方法，則高、低劑量組分別給予趕黃草總黃酮0.2g/(kg.d）、0.1g/(kg.d），空白對照組和模型組灌胃（ig）等量生理鹽水。藥物干預(yù)4weeks，期間自由飲食。2.2.2檢測樣本收集分別于造模第0、7、14、21、35、49d將大鼠置于代謝籠中24h，收集尿液并記錄尿液體積，3000r/min離心15min，測尿量白蛋白，觀察大鼠行為狀態(tài)，如采食、飲水、排泄、毛發(fā)、有無水腫等，并記錄體重、死亡量。大鼠禁食24h后于第29d乙醚麻醉，心臟采血，將血樣靜置2h，3000r/min離心5min，取上清，即得血清。2.2.3檢測指標1）尿蛋白定量測定將0.1mL離心后的尿液加入提前混合好的檢測試劑，37℃水浴孵育半小時取出，冷卻，用酶標儀測定吸光度值，檢測波長562nm，計算蛋白濃度。24h尿蛋白排泄量即為蛋白濃度乘以24h尿液總體積（mL）。2）血清生化指標測定使用生化測定儀（Konelabprime30，Thermoscientific，芬蘭）分析血清ALB、TP、TG、TC、BUN、Scr。3）病理組織分析取肝、心、脾、肺、腎稱重，將腎組織固定。用蒸餾水沖洗固定液，依次用15%、35%、55%、75%、95%、100%酒精脫水后，二甲苯透化，石蠟浸泡一段時間后包埋；切成3~5μm厚的切片，于60℃溫度下將切片中石蠟烤化。分別進行HE染色和Masson染色，透明及封片后進行光鏡檢查。2.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計處理試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果用?±s表示，采用方差分析進行多組均數(shù)比較，兩兩均數(shù)比較則采用q檢驗，若p<0.05，則表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果與討論3.1造模藥物劑量及動物初始體重選擇阿霉素又名多柔比星，為廣譜抗腫瘤藥物，具有一定的細胞毒性，阿霉素可較好制備與人類相似的腎病綜合征模型，因此本文選用阿霉素復(fù)制穩(wěn)定的腎病綜合征模型。包玉龍等[7]考察了不同劑量的阿霉素對大鼠死亡率的影響，發(fā)現(xiàn)阿霉素劑量跟大鼠的死亡率有相關(guān)性，李愛平等對阿霉素的造模劑量以及大鼠造模起始體質(zhì)量進行了考察，確定了腎病綜合征大鼠模型的造模劑量：阿霉素累計劑量為5mg/kg,分兩次給藥，第一天尾iv注射4mg/kg,隔一周注射1mg/kg。對于大鼠造模起始體質(zhì)量的選擇，發(fā)現(xiàn)起始體質(zhì)量約300g的大鼠對阿霉素具有較強的反應(yīng)，因此本試驗初期對體質(zhì)量為150~200g和250~300g大鼠造模后21d內(nèi)的死亡率進行了比較，發(fā)現(xiàn)體重為150~200g的大鼠死亡率為30.77%，高于體質(zhì)量為250~300g的大鼠的死亡率，因此最終選擇阿霉素(4+1)mg/kg的劑量，起始體質(zhì)量達到250g以上的大鼠制備腎病綜合征模型。3.2一般狀態(tài)觀察造模過程中，空白組喜飲食，大便正常成形，毛發(fā)光澤不易脫落，活潑好動。其他組造模后大鼠飲食量明顯偏少，嗜睡，活動量少，尿量偏少，毛發(fā)凌亂無光澤，大便偏稀顏色偏黑不成形，少數(shù)幾只出現(xiàn)鼻孔眼睛出血現(xiàn)象。由于尾靜脈注射阿霉素操作不當，造成阿霉素泄露，10只大鼠出現(xiàn)爛尾現(xiàn)象。造模第10d開始除正常對照組外各組均出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，造模14d后，除正常對照組外，其他組大鼠均出現(xiàn)四肢、口鼻、陰囊紅腫，行走困難等現(xiàn)象。給藥4w，模型組大鼠狀態(tài)無明顯改善，醋酸潑尼松組和趕黃草總黃酮高、低治療組大鼠飲食、活動量、四肢陰囊紅腫、尿量、體重均有明顯好轉(zhuǎn)。3.3各組大鼠死亡情況除正常組外，造模及給藥期間其他各組共有6只老鼠死亡，解剖后均出現(xiàn)腸脹氣現(xiàn)象，模型組死亡3只，1只解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟有多數(shù)白色顆粒狀小點，2只右腎偏白，醋酸潑尼松組、趕黃草總黃酮高低劑量組各1只，解剖后均發(fā)現(xiàn)其中一只腎臟偏白。模型組死亡率達23.08%，略高于李愛平等研究中模型組的死亡率（13.33%），可能是造模給藥時推注速度過快以及阿霉素泄露于皮下和皮膚導(dǎo)致大面積爛尾所致，具體死亡數(shù)見表1。組別死亡數(shù)/總動物數(shù)總死亡率（%）0天7天14天21天35天49天空白對照組0/80/80/80/80/80/80模型組0/130/131/131/133/133/1323.08%醋酸潑尼松組0/130/131/131/131/131/137.69%趕黃草總黃酮高劑量組0/130/131/131/131/131/137.69%趕黃草總黃酮低劑量組0/130/130/131/131/131/137.69%表1各組大鼠死亡情況2.4體質(zhì)量及各臟器指數(shù)由表2可知，將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2w后，體質(zhì)量達250g以上即開始造模，空白組大鼠體質(zhì)量增加了51.76%，從造模第0d開始到第14d，除空白組外其他組大鼠體重均呈下降趨勢，下降率分別為3.16%、3.61%、2.86%、4.33%，此時，空白組大鼠體質(zhì)量與模型組、趕黃草總黃酮高低劑量治療組相比具顯著性差異。14d后體質(zhì)量開始緩慢增長，造模21d后給予不同藥物干預(yù)，第21d到35d，模型組、醋酸潑尼松組、趕黃草總黃酮高低劑量組大鼠體質(zhì)量均有顯著性改善，增長率分別為5.44%、14.42%、13.47%、8.01%，但與空白組相比仍存在顯著性差異，且醋酸潑尼松組、總黃酮高劑量組兩組增長速度明顯高于模型組和總黃酮低劑量組，35d到49d，模型組體質(zhì)量上升至310.14g，各藥物治療組體質(zhì)量基本保持不變，結(jié)果顯示給予趕黃草總黃酮干預(yù)后，腎病綜合征大鼠的體質(zhì)量得到明顯改善。由表3可知，與空白組相比其他各組大鼠的肝臟左腎右腎指數(shù)；模型組大鼠脾臟指數(shù)以及總黃酮低劑量組大鼠肺臟指數(shù)均存在顯著性差異（p<0.01）。說明高劑量趕黃草總黃酮可明顯回調(diào)大鼠的肝臟、脾臟、左腎和右腎指數(shù)。表2各組大鼠體重變化時間/d體重/g空白對照組模型組醋酸潑尼松組趕黃草總黃酮高劑量組趕黃草總黃酮低劑量組0252.94±6.89273.01±4.37274.95±3.99269.48±5.59271.93±4.577265.95±11.24261.00±5.38260.77±6.38260.05±5.96263.27±5.5614283.92±6.94264.38±8.17265.01±11.21261.78±5.35260.15±7.0021307.50±13.39271.83±15.36275.86±13.89278.95±6.12278.77±10.0935366.16±14.48286.62±23.8315.65±13.5316.53±10.6301.11±10.7449383.86±42.29310.14±21.43313.55±17.59316.14±10.84301.83±10.04表3大鼠各臟器指數(shù)組別臟器指數(shù)×100空白對照組模型組醋酸潑尼松組趕黃草總黃酮高劑量組趕黃草總黃酮低劑量組肝2.28±0.123.09±0.122.93±0.192.77±0.092.83±0.15心0.29±0.010.34±0.020.33±0.010.33±0.010.31±0.01脾0.13±0.0030.20±0.0210.16±0.0060.15±0.0070.18±0.009肺0.43±0.0180.46±0.0090.47±0.0200.48±0.0210.49±0.014左腎0.30±0.0060.36±0.0130.33±0.0090.34±0.0080.34±0.011右腎0.30±0.0090.36±0.0080.33±0.0110.34±0.0050.34±0.0112.5各組大鼠血清生化指標由表4可知，與空白組相比，模型組大鼠TC、TG、BUN水平分別增加76.15%、105.26%、28.83%，ALB、TP水平分別降低13.25%、15.02%，與寧華英等研究結(jié)果相似；總黃酮低劑量組大鼠的TC水平顯著升高；與模型組相比，醋酸潑尼松組、趕黃草總黃酮高劑量組大鼠TC水平分別降低32.81%、36.98%；醋酸潑尼松組、總黃酮高低劑量組大鼠TP水平增加了10.02%、9.85%、11.86%，TG水平降低34.61%、30.77%、37.18%，均具有顯著性差異（p<0.01），說明醋酸潑尼松和趕黃草總黃酮高劑量組均可改善腎病綜合征大鼠血清中TP、TC、TG水平，趕黃草總黃酮低劑量組可改善TP和TG水平。說明趕黃草總黃酮可下調(diào)腎病綜合征模型大鼠的總膽固醇和甘油三酯水平，上調(diào)總蛋白。表4各組大鼠血清生化指標生化指標空白對照組模型組醋酸潑尼松組趕黃草總黃酮高劑量組趕黃草總黃酮低劑量組TP/(g/L)71.62±2.1760.86±1.7366.96±1.6166.86±2.3668.08±2.17TC/(mmol/L)1.09±0.101.92±0.161.29±0.221.21±0.101.54±0.12TG/(mmol/L)0.38±0.030.78±0.070.51±0.060.54±0.050.49±0.04ALB/(g/L)35.62±1.8730.90±0.6533.09±1.2132.59±2.0935.17±1.39BUN/(mmol/L)*4.89±0.296.30±0.485.82±0.405.63±0.225.86±0.38Scr/(μmol/L)33.01±1.3732.48±1.9031.11±1.8531.74±2.2531.70±1.222.6大鼠24h尿蛋白測定腎病綜合征可由多種不同病理類型的腎小球病變引起，尿蛋白量的高低可較準確反映腎小球功能。由表5可見，造模給藥14d，與空白對照組大鼠相比，各組大鼠尿蛋白水平顯著升高，具統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),造模第21d，模型大鼠24h尿蛋白量達到106.23mg，超過100mg,表明腎病綜合征大鼠模型制備成功，故從造模第21d后給予不同藥物干預(yù)，藥物干預(yù)后，與模型組相比，醋酸潑尼松組、趕黃草總黃酮高低劑量組尿蛋白水平分別降低123.34mg、97.95mg、80.17mg。結(jié)果表明，趕黃草總黃酮高低劑量均可不同程度降低腎病綜合征大鼠尿蛋白量水平。時間/d體重/g空白對照組模型組醋酸潑尼松組趕黃草總黃酮高劑量組趕黃草總黃酮低劑量組08.75±3.968.90±3.628.75±4.009.03±4.279.00±3.28710.00±1.9810.79±2.6511.69±1.949.68±3.2111.03±2.751411.38±1.0831.16±3.0729.65±4.2234.06±3.9228.79±3.672111.96±4.91106.23±6.49112.71±7.13104.94±4.52109.26±5.86359.18±8.31149.20±6.5626.41±5.2364.27±10.0164.70±8.144910.98±8.10138.26±10.8614.92±9.9140.31±15.9758.09±18.93表5各組大鼠24h尿蛋白定量4結(jié)論腎病綜合征臨床上常規(guī)使用激素治療，短期見效快，但長期使用給患者帶來一系列毒副作用。中醫(yī)學(xué)認為腎病應(yīng)歸屬于“水腫”、“癃閉”、“尿濁”、“虛勞”、“腰痛”之列，大量研究顯示中藥在治療該病方面有獨特的辨證論治優(yōu)勢，對緩解腎臟損傷，降低蛋白尿，減少并發(fā)癥具有重要的治療意義。研究者盧芙蓉用葫蘆巴，焦志娜用黃芪，鐘瑜用魚腥草證明分別在尿蛋白，T淋巴細胞的雙向調(diào)節(jié)功能，血膽固醇，總蛋白等指標上有明顯的改善。進來有研究顯示趕黃草提取液能降低大鼠尿蛋白水平，具有在高糖環(huán)境下保護腎臟功能的作用，為趕黃草總黃酮治療腎病綜合征提供了理論和實踐基礎(chǔ)。該研究得出趕黃草總黃酮高低劑量均可降低腎病綜合征大鼠TC、TG水平，高劑量總黃酮可升高TP水平，趕黃草總黃酮高低劑量均可降低腎病綜合征大鼠24h尿蛋白量且不同程度的保護腎臟細胞和降低腎臟纖維化。以趕黃草歸腎經(jīng)，主治水腫展開趕黃草對各種腎臟疾病的研究，為趕黃草用于臨床治療腎病綜合征提供基礎(chǔ)。參考文獻[1]屈曉宇,高秋玉,鄧小寬,高平.趕黃草總黃酮樹脂精制工藝與檢測方法[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),201