ICS65.020.30CCSICS65.020.30CCSB44內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T3359—2024綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程Technicalcodeoninvitroembryoproductioninsheep2024-02-232024-02-232024-03-23內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB15/T3359—2024前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古賽諾種羊科技有限公司。IIDB15/T3359—2024綿羊體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了綿羊體外胚胎生產(chǎn)過程中的卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和早期胚胎體外培養(yǎng)等內(nèi)容。本文件適用于綿羊體外胚胎生產(chǎn)程序。（NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本文件。體外成熟invitromaturation（IVM）卵母細(xì)胞在體外恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期（MII）這一過程，經(jīng)歷細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟。體外受精invitrofertilization（IVF）哺乳動物的精子和卵子置于適宜的培養(yǎng)條件下使之完成受精的一種技術(shù)。體外培養(yǎng)invitroculture（IVC）將受精卵置于適宜的培養(yǎng)條件下使其發(fā)育至囊胚期。4體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制采卵液、體外成熟培養(yǎng)液（IVM液）、受精液（IVF液）和胚胎發(fā)育液（IVC液）配方見附錄A。5操作前準(zhǔn)備1DB15/T3359—202420min30min756卵母細(xì)胞體外成熟揀卵針用酒精燈將采卵用玻璃管拉制成口徑適宜的撿卵針，管口在火焰上燒圓鈍。35mm10μL3.5L，52h檢卵3760mm35mm37體外成熟7體外成熟15/100μL～20/100μL化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)22h～24h。培養(yǎng)條件：5%CO2、95%空氣、38.6℃、飽和濕度。8卵母細(xì)胞體外受精準(zhǔn)備工作5%（IVF）2h～3h；38.6℃預(yù)熱0.2%的透明質(zhì)酸酶工作液。體外受精選擇體外受精效果好的精液，并根據(jù)體外成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量計(jì)算所需的精液量。如使用冷凍精液，將所需精液置于37℃～40℃水浴解凍。取約3μL精液置于載玻片上，蓋上蓋玻片后，顯微鏡下檢查精子活力和密度。2DB15/T3359—20248.2.4精子上游37100μL500μL38.65%CO230min。卵母細(xì)胞處理22h～24h0.22～3350/500μL～60/500μL（15/100μ～20枚/100μL受精液的密度移入受精液中。體外受精230min200μL～300μL1500r/min4min30μL～50μL1106/mL～1107個(gè)/mL38.6℃、5%CO20h。29體外培養(yǎng)20hIVC20hIVCIVC3）50/500μL～60/500μLIVC（）15/100μL～20/100μLIVCIVC90%N2、5%O2、5%CO2、38.6℃、飽和濕度。胚胎發(fā)育鑒定48h（）168h10記錄（態(tài)，將其分為A、B、C級）、退化卵數(shù)（胞質(zhì)不均勻、卵丘擴(kuò)散嚴(yán)重、裸卵數(shù)）；記錄卵母細(xì)胞成熟時(shí)間、培養(yǎng)的卵母細(xì)胞數(shù)量、卵丘擴(kuò)展情況、卵裂率、囊胚率。3DB15/T3359—2024附錄A（資料性）體外胚胎生產(chǎn)培養(yǎng)液配制20.02IU/mLFSH、0.02IU/mLLH、1μg/mLE、0.1mmol/L半胱胺、10-7mol/L褪黑素、10%FBS、0.1ml青鏈霉素合劑，使用TCM-199培養(yǎng)基定容至10mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃～5℃條件下可保存2周。20.05gBSA、0.035g肝素鈉、0.5mL青鏈霉素合劑，使用PBS定容至50mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃～5℃條件下可保存2周。SOF3.1452gNaCl、0.2675gKCl、0.0814gKH2PO4、0.0442gMgSO4、0.2655g丙酮酸鈉、1.3115gCaCl2、0.0251g肌醇、0.0074g谷氨酰胺、300μL乳酸鈉、0.5mL青鏈霉素合劑、1%酚紅，使用胚胎水定容至50mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃～5℃條件下可保存2周。(IVF1mL發(fā)情羊血清、6IU/ml肝素鈉,使用SOF液定容至50mL，混勻后用Millipore0.22μm的過濾1mL發(fā)情羊血清、6IU/ml肝素鈉,使用SOF液定容至50