2024/4/11發(fā)酵下游技術——1產物分離提純技術4/1/20242024/3/311發(fā)酵下游技術——1產物分離提純技術3/312024/4/12本部分內容5.1概述

5.2發(fā)酵液預處理5.3細胞破碎的原理與技術5.4發(fā)酵產物的分離純化原理與技術4/1/20242024/3/312本部分內容5.1概述3/31/202精品資料精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒有總結一節(jié)課的重點的難點，你是否會認為老師的教學方法需要改進？你所經歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽曬，也不怕那風雨狂，只怕先生罵我笨，沒有學問無顏見爹娘……”“太陽當空照，花兒對我笑，小鳥說早早早……”【發(fā)酵工藝學總論】發(fā)酵下游技術--ppt課件45.1概述一、下游加工技術的重要性二、下游加工技術的特點三、發(fā)酵產物的分類四、發(fā)酵產物提純的步驟和方法五、提取精制過程中應注意的問題六、發(fā)酵工程下游加工過程的基本原理七、發(fā)酵工程下游加工過程的一般程序4/1/20245.1概述一、下游加工技術的重要性3/31/20245一、下游加工技術的重要性

a.產品分離純化是最終獲得商業(yè)產品的環(huán)節(jié)。

b.投資費用高（抗生素、乙醇、檸檬酸占60%）。

c.分離純化技術落后會阻礙發(fā)酵工程技術的發(fā)展。5.1概述4/1/2024一、下游加工技術的重要性5.1概述3/31/20246幾種產品在發(fā)酵液中的濃度產品典型濃度（g/L）抗生素25

氨基酸100

酒精100

有機酸100

酶20

蛋白質104/1/20243/31/20247二、下游加工技術的特點

a.發(fā)酵液的復雜性造成分離上的困難性。

b.欲提取的產物通常濃度低且很不穩(wěn)定。

c.多為分批操作，各批發(fā)酵液不盡相同，要求下游加工有一定彈性。4/1/2024二、下游加工技術的特點3/31/20248三、發(fā)酵產物的分類從工業(yè)發(fā)酵范疇來看，從發(fā)酵液中獲得的發(fā)酵產物大致可分為三類：菌體：

酶：

代謝產物4/1/2024三、發(fā)酵產物的分類3/31/20249四、發(fā)酵產物提煉的步驟和方法影響提煉方法的因素

產物類型不同，提取、精制的方法不同。如：分離菌體胞內酶與代謝產物的方法明顯不同；

產物類型相同，但結構不同，提取精制方法不同。

產物酸堿性、水溶性等不同，方法不同。4/1/2024四、發(fā)酵產物提煉的步驟和方法3/31/202410如何著手對一種未知的發(fā)酵產品進行提取。(1)產品的類型，性質的研究。①可大致確定它是屬于哪一類型；②可了解它是一種成分還是幾種成分的混合物。(2)穩(wěn)定性研究。確定在哪一種條件下進行提取和精制不受破壞，即確定提取條件。4/1/2024如何著手對一種未知的發(fā)酵產品進行提取。3/31/202411發(fā)酵產物的提取和精制——濃縮純化，四個步驟：(1)預處理：改變發(fā)酵液物理性質。(2)提取：分離出目的物及其性質相似物。(3)精制：除去相似物，精煉目的。(4)后加工：使用要求決定。4/1/2024發(fā)酵產物的提取和精制——濃縮純化，四個步驟：3/31/20212常用提取方法：離子交換樹脂法膜分離法凝膠層離法沉淀法吸附法溶媒萃取法常用精制方法：

除了上述幾種外，還含濃縮、結晶、干燥、蒸餾等。其方法的選擇：取決于醪特性、菌種、產物性質。4/1/2024常用提取方法：3/31/202413五、提取精制過程中要注意的問題：防變性和降解；防輔基流失；防醪中所需產物被分解或揮發(fā)；基本原則:快速操作、低溫環(huán)境、溫和條件如pH值選擇在目標物質的穩(wěn)定范圍內，盡可能小的剪切作用和防止污染。4/1/2024五、提取精制過程中要注意的問題：3/31/202414六、發(fā)酵工程下游加工過程的基本原理生物物質的分離方法與一般化學方法雖然有許多不同特點，但在原理上又有許多是相同的根據混合物中不同組分分配率的差異，將其分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相中(如溶劑提取、鹽析、結晶等)，或將混合物置于某一物相中(主要是液相)，外加一定的作用力，使各組分分配于不同區(qū)域，而達到分離純化的目的(如電泳、超離心、超濾等)。4/1/2024六、發(fā)酵工程下游加工過程的基本原理3/31/202415七、發(fā)酵產物提取與精制的一般流程四大階段：預處理和固液分離階段、初步提取分離階段、純化精致階段、成品加工階段4/1/2024七、發(fā)酵產物提取與精制的一般流程四大階段：預處理和固液分離階165.2發(fā)酵液的預處理4/1/20245.2發(fā)酵液的預處理3/31/2024174/1/20243/31/2024184/1/20243/31/2024194/1/20243/31/202420三、固液分離

固液分離是將懸浮液中的固體和液體分離的過程，如將發(fā)酵液中的細胞、菌體、細胞碎片以及蛋白質沉淀物等物質分離。常規(guī)的固液分離技術主要有過濾和離心分離等。4/1/2024三、固液分離固液分離是將懸浮液中的固體和液體分離的過程，215.3細胞破碎的原理與技術4/1/20245.3細胞破碎的原理與技術3/31/2024224/1/20243/31/2024234/1/20243/31/202424三、破碎率測定1、直接測定：染色、細胞計數(shù)2、目的產物測定：與完全破碎率的得率比較。3、導電率測定。4/1/2024三、破碎率測定1、直接測定：染色、細胞計數(shù)3/31/202425四、破碎技術發(fā)展1、多種方法結合2、與菌種和發(fā)酵過程結合：包涵體的形成、引入噬菌體基因、耐高溫產品等。3、與下游分離過程結合。權衡點：高的產物釋放率、低的能耗和便于后步提取4/1/2024四、破碎技術發(fā)展1、多種方法結合權衡點：高的產物釋放率、低26

5.4發(fā)酵產物的分離純化原理與技術一、沉淀分離技術二、萃取分離技術三、吸附分離技術四、膜分離技術五、離子交換分離技術六、層析分離技術七、成品加工2024/4/1274/1/2024

5.4發(fā)酵產物的分離純化原理與技術一、沉淀分離技術2027沉淀是指溶液中的溶質在適當條件下由液相變成固相而析出的過程。分離過程中采用沉淀技術，其目的有兩個：一是通過沉淀使目標成分達到濃縮和去除雜質的目的；二是通過沉淀可將已純化的產品由液態(tài)變成固態(tài)，有利于保存和進一步的加工處理。

一、沉淀分離技術

5.4發(fā)酵產物的分離純化原理與技術4/1/2024沉淀是指溶液中的溶質在適當條件下由液相變成固相而析出的過程。28

當鹽濃度增加到一定程度時，在鹽離子的作用下，水活度大大降低，同時蛋白質表面的電荷被大量中和，使蛋白質分子之間電排斥作用減弱而相互聚集；而且，中性鹽的親水性比蛋白質大，鹽離子在水中發(fā)生水化而破壞蛋白質分子外表的水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用而使蛋白沉淀析出，即鹽析。1、鹽析法4/1/2024當鹽濃度增加到一定程度時，在鹽離子的作用下，水活度大大29常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鉀、醋酸鈉、硫氰化鉀等。在蛋白質的鹽析中，以硫酸銨應用最廣。鹽析的操作：pH蛋白質、酶等經過鹽析沉淀分離后，產品夾帶有鹽分，需脫鹽處理。常用的方法有透析法、電滲析法和葡聚糖凝膠過濾法等。4/1/2024常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鈉、磷酸鉀、氯化鉀30

與無機沉淀劑相比，有機沉淀劑的優(yōu)點在于：（1）選擇性比較高，即一定濃度的有機沉淀劑只沉淀分離某一種或某一類溶質組分；（2）沉淀后所得產品不需脫鹽，殘留的沉淀劑通過揮發(fā)而易于去除。有機沉淀劑的缺點是對有些生物大分子如酶類有失活作用，因而常需在低溫下操作。

2、有機溶劑沉淀分離法4/1/2024與無機沉淀劑相比，有機沉淀劑的優(yōu)點在于：2、有機溶劑沉淀分31機理：（1）有機溶劑改變了溶液的介電常數(shù)。加入有機溶劑后，降低了溶液介電常數(shù)，因而增強了溶質分子間的靜電作用力，降低了溶質分子與溶劑分子間的相互作用，導致溶質分子間發(fā)生聚合而析出。（2）脫水作用。由于有機溶劑必須溶解在水溶液中，這樣就減少了溶質與水的作用，因而使溶質脫水而相互聚集沉淀。

4/1/2024機理：3/31/2024323、等電點沉淀法4、變性沉淀分離法

加熱、加有機酸、調pH

4/1/20243、等電點沉淀法3/31/202433二、萃取分離技術

利用溶質在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質得到純化或濃縮的方法稱為萃取。

4/1/2024二、萃取分離技術利用溶質在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同341、有機溶劑萃取

物理萃取即溶質根據相似相溶的原理在兩相間達到分配平衡，萃取劑與溶質之間不發(fā)生化學反應。化學萃取則利用脂溶性萃取劑與溶質之間的化學反應生成脂溶性復合分子實現(xiàn)溶質向有機相的分配，萃取劑與溶質間的化學反應包括離子交換和絡合反應等。

4/1/20241、有機溶劑萃取3/31/2024352、雙水相萃取溶劑萃取法，一般是將水溶液中的溶質萃取到有機溶劑中，這會使許多生物大分子在有機溶劑中失活變性。雙水相系統(tǒng)中多聚物的水溶液給生物分子提供溫和的環(huán)境。雙水相萃取可直接從細胞破碎勻漿中萃取蛋白質，無需分離細胞碎片。

4/1/20242、雙水相萃取3/31/2024362024/4/1374/1/20242024/3/31373/31/2024373、反膠束提取純化技術將表面活性劑溶于非極性溶劑（有機溶劑）中，并使其濃度超過臨界膠束濃度，便會在有機溶劑內形成聚集體，這種聚集體即為反膠束。在反膠束中，表面活性劑的非極性基團在外，與非極性的有機溶劑接觸，而極性基團則排列在內，形成一個極性的核，此極性核可以溶解極性物質（水溶液）。4/1/20243、反膠束提取純化技術3/31/202438形成含生物大分子的反膠團的常用方法有：（1）相轉移法通過將含生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機相接觸，緩慢地攪拌，在形成反膠團的同時，其中的生物大分子即轉入到反膠團中。（2）注入法通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機相中，從而實現(xiàn)萃取過程。4/1/2024形成含生物大分子的反膠團的常用方法有：3/31/202439（3）溶解法對于固體粉末中含有的生物大分子，可采用溶解法。先制備好含水的反膠束的有機溶液，然后把含生物大分子的固體粉末加進此種反膠束的有機溶液中，同時攪拌，生物大分子慢慢地進入到反膠束內的水中心而實現(xiàn)萃取過程。4/1/2024（3）溶解法對于固體粉末中含有的生物大分子，可采用溶解法404、超臨界萃取技術超臨界萃取是以超臨界流體作為萃取劑，在臨界溫度和臨界壓力附近的條件狀態(tài)下，從液體或固體物料中萃取出待分離的組分，又稱為壓力液體萃取、超臨界氣體萃取等。4/1/20244、超臨界萃取技術3/31/202441三、吸附分離技術

吸附是溶質從液相或氣相轉移到固相的現(xiàn)象。吸附分離法是利用不同組分（溶質）在吸附劑表面吸附和解吸能力的差異進行分離的方法。吸附劑一般為多孔微粒，具有很大的比表面積。

4/1/2024三、吸附分離技術吸附是溶質從液相或氣相轉移到固相的現(xiàn)象。吸42四、膜分離技術1、膜分離技術原理

用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學位差為推動力，對雙組分或多組分的溶液進行分離、分級、提純和富集的方法，統(tǒng)稱為膜分離法

4/1/2024四、膜分離技術1、膜分離技術原理3/31/2024434/1/20243/31/2024442、膜分離技術的特點膜分離技術一般在常溫下操作，不需加熱，被分離的物質能保持原來的性質，能保持生物物質的活性。其選擇性強，操作過程簡單，適用范圍廣。膜分離技術在分離物質過程中不涉及相變，無二次污染?？煞峙蜻B續(xù)操作，易于自動化和擴大生產規(guī)模，分離效率高。其缺點是：膜易污染而使其性能降低，合成材料制成的膜在耐熱、耐化學腐蝕等方面不理想。

4/1/20242、膜分離技術的特點3/31/2024453、微濾一般采用深度過濾膜作預過濾，再用微孔濾膜精確分離大小不同的各種顆粒或細菌。深度過濾膜是由不規(guī)則放置的纖維構成的網狀孔道而形成的濾網，用于去除過濾液中的粗大顆粒雜質以保護后續(xù)的微濾膜。微孔濾膜是一組由多層的網狀小孔緊密連接而成的薄片，每層的網孔均有一定的孔徑，孔徑的大小由產品的性能而定，濾膜的孔徑從0.45um到0.2um、0.1um。4/1/20243、微濾3/31/2024464、超濾所謂超濾，就是在一定壓力（0.1-1MPa）下將溶液通過孔徑非常?。?0-10000?）的濾膜，使溶液中溶劑、無機鹽和小分子物質透過薄膜，而截留溶液中的懸浮物、膠體、微生物等大分子物質，從而達到液體凈化、分離與濃縮的目的。大多數(shù)超濾膜是由一層非常薄的功能膜與較厚的支撐膜結合在一起組成的。超濾過程與反滲透過程非常接近，只是超濾膜孔徑稍大，而反滲透操作壓力較高。4/1/20244、超濾3/31/2024475、反滲透原理：當把相同體積的稀溶液和濃液分別置于一容器的兩側，中間用半透膜阻隔，稀溶液中的溶劑將自然的穿過半透膜，向濃溶液側流動，濃溶液側的液面會比稀溶液的液面高出一定高度，形成一個壓力差，達到滲透平衡狀態(tài)，此種壓力差即為滲透壓。若在濃溶液側施加一個大于滲透壓的壓力時，濃溶液中的溶劑會向稀溶液流動，此種溶劑的流動方向與原來滲透的方向相反，這一過程稱為反滲透。4/1/20245、反滲透3/31/202448五、離子交換分離技術

離子交換分離法是利用溶液中的溶質離子與離子交換樹脂的活性離子交換時結合力大小不同而進行分離的一類方法，在發(fā)酵工程中，離子交換法廣泛應用于水的處理和小分子產物如氨基酸、有機酸的提取。

4/1/2024五、離子交換分離技術離子交換分離法是利用溶液中的溶質離子與492024/4/1504/1/20242024/3/31503/31/2024501、離子交換樹脂的類型

離子交換樹脂由不溶性的高分子聚合物骨架、功能基團和活性離子三部分組成。在水溶液中，樹脂的活性離子可從功能基團上解離下來，在骨架與溶液間自由遷移，并可與溶液中的同性離子發(fā)生離子交換作用。若活性離子為陽離子，可與溶液中的其他陽離子發(fā)生交換，則這類樹脂稱為陽離子交換樹脂；若活性離子為陰離子，可與溶液中的其他陰離子發(fā)生交換，則這類樹脂稱為陰離子交換樹脂。

4/1/20241、離子交換樹脂的類型3/31/202451（1）強酸性陽離子交換樹脂強酸性陽離子交換樹脂含有磺酸基-SO3H等強酸性官能團，由于強酸性陽離子交換樹脂的離解能力很強，其離解程度不隨外界溶液的pH的大小而變化，因此使用時pH沒有限制。此外，以磷酸基-PO(OH)2和次磷酸基-PHO(OH)作為活性基團的樹脂具有中等強度的酸性。

4/1/2024（1）強酸性陽離子交換樹脂3/31/202452（2）弱酸性陽離子交換樹脂弱酸性陽離子交換樹脂一般含有-COOH、-OH等弱酸性官能團，電離程度小，其離解和交換性能與溶液pH有很大的關系。在溶液pH較低時，幾乎不會發(fā)生離子交換作用，只有在堿性、中性或微酸性溶液中才能進行離解和離子交換。使用時R-COOH應在pH>6的溶液中操作，R-OH應在pH>9的溶液中操作。4/1/2024（2）弱酸性陽離子交換樹脂3/31/202453（3）強堿性陰離子交換樹脂強堿性陰離子交換樹脂含有季胺基（NR3OH）等強堿性基團，離解性強，使用時不受溶液pH限制。（4）弱堿性陰離子交換樹脂弱堿性陰離子交換樹脂含有伯胺基、仲胺基、叔胺基或吡啶基等弱堿性基團，離解能力較弱，只能在較低pH下進行離子交換操作。4/1/2024（3）強堿性陰離子交換樹脂3/31/2024542、離子交換樹脂的理化性能（1）顆粒度（2）交聯(lián)度交聯(lián)度的大小決定著樹脂的網狀結構的疏密和機械強度，同時交聯(lián)度的變化還可使樹脂對大小不同的各種離子具有選擇性通過的能力。交聯(lián)度不易測準，故常用與之有關的深脹水和膨脹系數(shù)來表征。4/1/20242、離子交換樹脂的理化性能3/31/202455（3）孔度、孔徑、比表面積孔度是指每單位質量或體積樹脂所含有的孔隙體積；孔徑大小對離子交換樹脂的選擇性影響很大，凝膠樹脂的孔徑決定于交聯(lián)度；比表面積與樹脂的吸附量和交換速度有關。4/1/2024（3）孔度、孔徑、比表面積孔度是指每單位質量或體積樹脂所56（4）交換容量交換容量是表征樹脂性能的重要參數(shù)，它反映樹脂與溶液中離子進行交換的能力。交換容量通常以單位質量干樹脂或單位體積濕樹脂所能吸附的一價離子的毫摩爾數(shù)表示，可用酸堿滴定法測定。4/1/2024（4）交換容量交換容量是表征樹脂性能的重要參數(shù)，它反映樹573、樹脂和操作條件的選擇選擇合適的樹脂是應用離子交換法分離物質的關鍵。選擇時首先要考慮待分離物質的荷電性質，若在其穩(wěn)定的pH下帶正電荷，選用陽離子交換樹脂；帶負電荷則選擇陰離子交換樹脂。其次要兼顧吸附和解吸難易情況，一般對強堿性物質宜選用弱酸性樹脂，弱堿性物質宜選用強酸性樹脂；同樣，強酸性物質宜選用弱堿性樹脂，弱酸性物質宜選用強堿性樹脂。對兩性物質如蛋白質等，要根據其等電點來選擇樹脂類型。4/1/20243、樹脂和操作條件的選擇3/31/202458六、層析分離技術

層析技術也稱為色譜或色層技術，是基于物質溶解度、蒸氣壓、吸附能力、立體結構或離子交換等物理化學性質的微小差異，使其在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，而當兩相作相對運動時，組分在兩相間進行連續(xù)多次分配，從而達到彼此分離。4/1/2024六、層析分離技術層析技術也稱為色譜或色層技術，是基于物質溶59按兩相物理狀態(tài)可分為氣-固色譜、氣-液色譜、液-固色譜、液-液色譜和超臨界流體色譜等；按固定相的形態(tài)包括柱色譜和平板色譜；按分離過程物理化學原理可分為吸附色譜、離子交換色譜、親和色譜、凝膠色譜等。

4/1/2024按兩相物理狀態(tài)可分為氣-固色譜、氣-液色譜、液-固色譜、液-601、吸附色譜

2、分配色譜

3、離子交換色譜

4、凝膠色譜

5、親和層析

4/1/20241、吸附色譜3/31/2024614/1/20243/31/2024624/1/20243/31/202463七、成品加工

1、濃縮

濃縮方法的選擇應視目的產物的熱穩(wěn)定性而定。對于熱穩(wěn)定的目的產物可用常規(guī)的水浴常壓蒸發(fā)、減壓蒸發(fā)等。中小規(guī)模的生產用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，生產規(guī)模較大時可用降膜式薄膜蒸發(fā)器濃縮。對于熱不穩(wěn)定的生物大分子通常采用超濾法濃縮、冷凍濃縮法和吸收濃縮法。

4/1/2024七、成品加工1、濃縮3/31/2024642、結晶

結晶是一個重要的化工單元操作，結晶過程具有高度選擇性，通常只有同類分子或離子才能結合成晶體，因此結晶操作能從雜質含量相當多的發(fā)酵液或溶液中析出純凈的晶體。結晶操作廣泛應用于氨基酸、有機酸、核苷酸、酶制劑等發(fā)酵生產的提取和精制過程。

4/1/20242、結晶3/31/202465結晶是