第1章

發(fā)酵工程第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用從社會中來這需要應(yīng)用無菌技術(shù)和微生物的培養(yǎng)技術(shù)。失敗

向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加某些對人體有益的細菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，由于制作工藝并不復(fù)雜，一些人會在家里自制酸奶，自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導(dǎo)致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。那么，怎樣才能保證無處不在的雜菌不混入發(fā)酵物中呢？酸奶①制作工具和原料滅菌②接種單一的菌種③控制發(fā)酵條件④避免雜菌進入第1課時

微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)1.

微生物的概念：微生物是難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括細菌、真菌、病毒及一些原生生物等。無細胞結(jié)構(gòu)原核細胞真核細胞真菌：酵母菌、毛霉等；原生生物：草履蟲、變形蟲等微生物的類群病毒：SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌體等DNA病毒細菌:藍細菌、大腸桿菌、乳酸菌等；放線菌:鏈霉菌等

本章提及的微生物主要指用于發(fā)酵的細菌和真菌。

_____________，

是研究和應(yīng)用微生物的前提，也是發(fā)酵工程的重要基礎(chǔ)。防止雜菌污染獲得純凈的微生物培養(yǎng)物

微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)難以用肉眼觀察到的微生物該如何培養(yǎng)呢？01培養(yǎng)基的配制實驗室培養(yǎng)微生物的條件(1)要為人們需要的微生物提供合適的___________條件。(2)要確保

，并將需要的微生物分離出來?！囵B(yǎng)基——無菌技術(shù)營養(yǎng)和環(huán)境其他微生物無法混入1.培養(yǎng)基概念：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。2.作用：用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物。3.培養(yǎng)基的類型:(1)按物理性質(zhì)：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基。(2)按化學(xué)組成：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基。(3)按目的用途：選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)有無凝固劑瓊脂半固體培養(yǎng)基觀察微生物的運動、分類鑒定固體培養(yǎng)基：呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。①液體培養(yǎng)基中加入瓊脂后制成的瓊脂固體培養(yǎng)基是實驗室最常用的培養(yǎng)基之一。②微生物在瓊脂固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長，可以形成肉眼可見的菌落。注意：凝固劑（如瓊脂），不能被微生物利用，只起到凝固作用。液體培養(yǎng)基瓊脂固體培養(yǎng)基加入瓊脂1.定義：單個或少數(shù)同種菌體在固體培養(yǎng)基上大量繁殖，形成肉眼可見的子細胞群體。2.特征：形狀、大小、顏色、光澤度、透明度等。3.功能：菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。知識補充：菌落沙門氏菌毛霉青霉菌酵母菌一個菌落就是一個種群強調(diào)：不同種類微生物的菌落特征各有特點,但彼此之間存在一定的相似性;同種微生物的菌落特征受培養(yǎng)時間、營養(yǎng)物質(zhì)的含量與種類等影響也會有所差異。劃分標準培養(yǎng)基種類特點用途物理性質(zhì)化學(xué)成分目的用途不加凝固劑加凝固劑，如瓊脂工業(yè)生產(chǎn)觀察微生物的運動、分類鑒定微生物分離、鑒定、活菌計數(shù)、保藏菌種含化學(xué)成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基成分明確分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品,用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基【注意】病毒為非細胞結(jié)構(gòu)生物，只能在活細胞中營寄生生活，目前不能利用人工培養(yǎng)基來培養(yǎng)?；旌蠘悠愤x擇培養(yǎng)基上部分菌種才能生長普通培養(yǎng)基上所有菌種都能生長選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基目的菌目的菌周圍出現(xiàn)特殊現(xiàn)象非目的菌非目的菌周圍無明顯現(xiàn)象培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有抗氨芐青霉素能力的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細菌培養(yǎng)基+氨芐青霉素培養(yǎng)基

沒有抗氨芐青霉素能力的菌落被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細菌?3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成注：牛肉膏和蛋白胨來源于動物，含有糖、維生素和有機氮等營養(yǎng)物質(zhì)。（1）一般都含有碳源、氮源、水、無機鹽碳源無機碳源：CO2、CO32-、HCO3-有機碳源：糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機酸、石油等自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物功能：①構(gòu)成細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②有機碳既是碳源又是能源。氮源無機氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有機氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等功能：主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝產(chǎn)物等。注：含C、H、O、N的有機物尿素[CO(NH2)2]除外是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源。無機鹽功能：提供無機營養(yǎng)

調(diào)劑PH

維持滲透壓水功能：良好的溶劑

維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定思考：為什么培養(yǎng)基需要氮源？氮是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)必須的元素。微生物的化學(xué)組成大體相同，主要由C、H、O、N、P、S等大量元素和Fe、Mn、Cu、Zn、B、Mo等微量元素組成，這些元素最終來自外界環(huán)境中的各種有機物和無機物。思考：為什么各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都有水、無機鹽、碳源和氮源？思考：培養(yǎng)微生物時，培養(yǎng)基中是否必須添加碳源和氮源？并說明理由。

例如，培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物時，一般不需要添加碳源，微生物可以利用空氣中的二氧化碳；培養(yǎng)固氮微生物時，一般不需要添加氮源，微生物可以利用空氣中的氮氣。（2）培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求。④培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供

的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加

；②培養(yǎng)霉菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；③培養(yǎng)細菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成主要指生長因子（微生物生長所必須的、微量的、自身不能合成或合成很少的有機物）種類：維生素、氨基酸、堿基、嘌呤、嘧啶、胺類等來源：酵母膏、蛋白胨、動植物組織提取液等物質(zhì)來源功能碳源無機碳源CO2、NaHCO3等含碳無機物①構(gòu)成細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物；②有機碳既是碳源又是能源有機碳源糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機酸等氮源無機氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽等將無機氮合成含氮的代謝產(chǎn)物有機氮源牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮的代謝產(chǎn)物水外界攝入①良好的溶劑；②維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定無機鹽無機物（Ca、K、Mg等大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素）為微生物提供除碳、氮以外的各種重要元素生長因子維生素、氨基酸、堿基①酶和核酸的組成成分；②參與代謝過程中的酶促反應(yīng)3.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成二、無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)的對象：（1）實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。（2）培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。注意：實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。為了避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染。2.無菌技術(shù)的類型（1）消毒①概念：使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。②適用對象：對操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒。（2）滅菌①概念：使用強烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物，包括芽孢和孢子。②適用對象：用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌。-----與消毒最本質(zhì)區(qū)別芽孢指某些細菌（如芽孢桿菌等）在一定條件下細胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。如某些細菌的芽孢煮沸3小時才死亡。每個細菌僅形成一個芽孢。孢子指細菌、真菌、原生動物和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的生殖細胞。正常情況下不需要兩兩結(jié)合就可以由單個細胞直接發(fā)育成新個體。知識拓展3.常用的消毒和滅菌方法19類型適用范圍操作方法消毒滅菌較為溫和理化方法，殺死部分微生物。強烈的理化方法，殺死所有微生物。煮沸消毒家庭餐具等生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒牛奶等不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化學(xué)藥劑生物活體（皮膚、傷口）、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線紫外線照射30min灼燒滅菌接種的金屬工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌培養(yǎng)基及多種器材和物品高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min接種室、接種箱，超凈工作臺（迅速徹底）4.防止雜菌污染的措施（1）實驗前：①對操作空間、操作人員消毒；②對所用器皿、接種用具和培養(yǎng)基滅菌。①避免已滅菌處理材料用具與周圍物品接觸造成污染；②為避免周圍微生物污染，實驗操作都應(yīng)在超凈工作臺并在酒精燈火焰旁進行。（2）操作時：（3）實驗后：使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。思考：無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？還能有效避免操作者自身被微生物感染。實戰(zhàn)演練：（1）培養(yǎng)基用什么方法滅菌？（2）培養(yǎng)皿用什么方法滅菌？（3）實驗操作者的雙手用什么方法消毒？（4）接種環(huán)用什么方法滅菌？（5）實驗室用什么方法消毒？（6）為保證無雜菌，實驗操作都要在哪里進行？（7）牛奶用什么消毒？灼燒滅菌超凈工作臺的酒精燈火焰旁巴氏消毒法濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）干熱滅菌化學(xué)藥物消毒（酒精）紫外線消毒微生物的純培養(yǎng)12345（一）相關(guān)概念純培養(yǎng)物培養(yǎng)物純培養(yǎng)在微生物學(xué)中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成的含有特定種類微生物的群體獲得純培養(yǎng)物的過程由單一個體繁殖所獲得的微生物群體配制培養(yǎng)基滅菌接種分離培養(yǎng)純培養(yǎng)的步驟：（二）酵母菌的純培養(yǎng)不同菌落的大小、形狀、光澤度、顏色等不同。

分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，這就是菌落。采用平板劃線法和稀釋涂布平板法能將單個微生物分散在固體培養(yǎng)基上，之后經(jīng)培養(yǎng)得到的單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。微生物群分散或稀釋單個細胞繁殖單菌落酵母菌菌落：濕潤，粘稠，易挑起，表面光華，比細菌的菌落大而厚。（二）酵母菌的純培養(yǎng)

目的要求

1.學(xué)會配制培養(yǎng)酵母菌的培養(yǎng)基并倒平板。2.學(xué)會進行無菌操作。3.嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。

材料用具

酵母菌培養(yǎng)液、馬鈴薯、葡萄糖(或蔗糖)、瓊脂、蒸餾水、天平、小刀、紗布、燒杯、錐形瓶、棉塞、牛皮紙(或報紙)、皮筋、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱和恒溫培養(yǎng)箱等。（二）酵母菌的純培養(yǎng)1.制備培養(yǎng)基稱取去皮的馬鈴薯200g切成小塊加水1000mL，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛用紗布過濾濾液中加入20g葡萄糖，15~20g瓊脂用蒸餾水定容至1000mL得到濾液(1).配制培養(yǎng)基：（二）酵母菌的純培養(yǎng)將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加棉塞包上牛皮紙，并用皮筋勒緊壓力100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min取5~8套培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿疊成一束用幾層牛皮紙包緊放入干熱滅菌箱內(nèi)，160~170℃滅菌2h(2)滅菌：1.制備培養(yǎng)基待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。(3)倒平板：倒平板注意事項：溫度：50℃左右冷凝后平板倒置操作：在酒精燈火焰附近1.制備培養(yǎng)基實驗注意事項1.培養(yǎng)基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時開始倒平板？2.為什么倒平板和接種整個過程要在酒精燈火焰旁進行？3.倒平板時為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？4.在倒平板的過程中，若不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固。避免雜菌污染

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

不能；因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。5.為什么倒平板時，將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？6.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？7.怎么確定所倒平板未被雜菌（主要是細菌）污染？防止雜菌污染培養(yǎng)基

可避免培養(yǎng)基中的水分過快蒸發(fā)；可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

將未接種的空白培養(yǎng)基放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。平板劃線法單個細胞微生物群單個菌落連續(xù)劃線稀釋分散生長繁殖①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅⑥將皿蓋打開一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線。2.接種和分離酵母菌：平板劃線法2.接種和分離酵母菌：劃3個平板（重復(fù)實驗）1個不劃線（空白對照）12345連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法平板劃線法注意事項（1）接種環(huán)只蘸一次菌液,但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次（2）劃線首尾不能相接（3）每次劃線前灼燒接種環(huán)進行滅菌（4）劃線操作結(jié)束后，仍需灼燒接種環(huán)平板劃線法2.接種和分離酵母菌：

在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？第二次及以后的劃線時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。思考

·

討論

為什么不能將最后一次的劃線與第一次的劃線相連？將聚集的菌種逐步稀釋，以便獲得單菌落。線條末端酵母菌的數(shù)目比起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使酵母菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到單菌落。菌種經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，分離得到單菌落。第一次劃線酵母菌數(shù)量多，最后一次劃線酵母菌數(shù)量少，首尾相連，不容易得到單個菌落。思考

·

討論

劃五次線，接種環(huán)需要灼燒幾次？12345第1次劃線接種環(huán)滅菌第2次劃線接種環(huán)滅菌第3次劃線接種前接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌第4次劃線接種環(huán)滅菌第5次劃線接種環(huán)滅菌需要灼燒6次。1123接種前，殺死接種環(huán)上的微生物，避免污染培養(yǎng)基2殺死殘留菌種，確保每次劃線菌種來自上次劃線的末端3劃線結(jié)束后，殺死殘留菌種，避免環(huán)境污染和感染操作者接種環(huán)三個不同時期灼燒的目的劃線前劃線時劃線后平板劃線法2.接種和分離酵母菌：

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-28h。既可以防止培養(yǎng)基表面的水分揮發(fā)；又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染作對照，該培養(yǎng)皿無菌落說明培養(yǎng)基沒有污染2.培養(yǎng)酵母菌：警示：在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環(huán)境。

未接種的培養(yǎng)基是不能有菌生長的，如果有菌生長，則說明受到污染或者滅菌不徹底。

正確的做法是，配好培養(yǎng)基之后，將培養(yǎng)基放在溫箱里培養(yǎng)24小時觀察，長菌的培養(yǎng)基應(yīng)該丟棄，無菌生長的方能使用。這樣做的另一個好處是將培養(yǎng)基水蒸發(fā)干，不會對微生物的培養(yǎng)產(chǎn)生影響。1.

在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有，說明了什么？2.

如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落，你認為可能是由哪些原因引起的？可能是接種的菌種不純、培養(yǎng)基滅菌不徹底，或接種過程中感染了雜菌。結(jié)果分析與評價（p13）1.微生物的純培養(yǎng)既需要適宜的培養(yǎng)基，又要防止雜菌污染。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)濃度越高，對微生物的生長越有利。（）（2）消毒和滅菌的殺菌程度存在差異。（）（3）微生物的純培養(yǎng)物就是不含有代謝廢物的微生物培養(yǎng)物。（）×√×練習(xí)與應(yīng)用（p14）一、概念檢測練習(xí)與應(yīng)用（p14）2.日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？干制—降低食品的水分含量；腌制—通過食鹽、糖等制造高滲環(huán)境，從而抑制微生物的生長和繁殖；低溫儲存—通過降低微生