項(xiàng)目三人干擾素α2b的生產(chǎn)任務(wù)五人干擾素α2b的疏水層析取經(jīng)離子交換層析純化后的洗脫液為原料，以O(shè)ctylSepharose4FF為填料開(kāi)展疏水層析操作，制得純度更高的人干擾素α2b料液。規(guī)范填寫(xiě)生產(chǎn)記錄。任務(wù)學(xué)習(xí)路徑見(jiàn)思維導(dǎo)圖。任務(wù)描述人干擾素α2b的疏水層析2任務(wù)支撐（一）人干擾素α2b疏水層析的目的與作用

疏水層析（HIC）和反相層析（RPC）都是基于料液中物質(zhì)分子的疏水基團(tuán)與層析介質(zhì)上的疏水基團(tuán)發(fā)生吸附作用，在非極性的固定相和極性的流動(dòng)相之間不斷分配而分離的技術(shù)。

本任務(wù)以O(shè)ctyl疏水填料，去除料液中與人干擾素α2b的疏水性有差異的雜質(zhì)，提高人干擾素α2b純度。人干擾素α2b的疏水層析疏水基團(tuán)3（二）疏水層析

疏水層析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）是利用表面偶聯(lián)弱疏水基團(tuán)（疏水性配基）的吸附劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)與疏水吸附劑之間可逆的疏水性相互作用差別，在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行生物分子分離與純化的層析法。適用于在藥物生產(chǎn)的中度純化階段；可用于捕獲和精制階段；適用作鹽析后的后續(xù)工序（在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大）4（二）疏水層析

2.疏水層析介質(zhì)

疏水層析介質(zhì)呈球狀，一般以剛性的、大孔的、載量大的惰性支撐骨架作基質(zhì)。利用氨基或醚鍵把基質(zhì)與發(fā)揮疏水性吸附作用的配基偶聯(lián)。

基質(zhì)為Sepharose瓊脂糖、硅膠、聚苯乙烯和聯(lián)乙烯苯等有機(jī)聚合物。

疏水配基主要為烷基和芳香基，其烷基通常不多于C8（如丁基、辛基和新戊基等），芳香基多為苯基5（二）疏水層析

2.疏水層析介質(zhì)常見(jiàn)的疏水層析配基丁基硫醚正丁烷基異丙基正辛烷基苯基基團(tuán)的疏水性自左向右增強(qiáng)6（二）疏水層析3.疏水層析技術(shù)機(jī)制

疏水作用是指水中蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子內(nèi)部，有聚集在一起形成最小疏水面積的趨勢(shì)。盡管蛋白質(zhì)將疏水基團(tuán)折疊在分子內(nèi)部而表面顯露極性，但是仍會(huì)有一些疏水基團(tuán)或疏水部位暴露在蛋白質(zhì)表面，苯丙氨酸和酪氨酸等疏水性氨基酸含量越大的蛋白質(zhì)，疏水性越強(qiáng)。溶菌酶示意（深色表示親水性氨基酸，淺色表示疏水性氨基酸）（1）疏水層析機(jī)制7（二）疏水層析3.疏水層析技術(shù)機(jī)制溶菌酶示意（深色表示親水性氨基酸，淺色表示疏水性氨基酸）（1）疏水層析機(jī)制鹽析作用解釋疏水層析蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度較高的鹽溶液中，表面水化層受破壞，露出疏水部位，疏水相互作用增大；相應(yīng)地，隨著鹽濃度降低，疏水相互作用減弱。疏水層析中上樣吸附蛋白質(zhì)是在高濃度鹽溶液中進(jìn)行洗脫是通過(guò)降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)緩沖液中離子強(qiáng)度降低，疏水性弱的蛋白質(zhì)先被洗脫。鹽濃度降得更低時(shí)有較強(qiáng)疏水相互作用的蛋白質(zhì)被洗脫。8（二）疏水層析3.疏水層析技術(shù)機(jī)制（2）影響疏水層析的因素PO43-，S042-，CH4COO-，C1-，Br-，NO3-，ClO4-，I-，SCN-NH4+，Rb+，K+，Na+，Cs+，Li+，Mg2+，Ca2+，Ba2+①離子強(qiáng)度及種類促進(jìn)疏水作用破壞疏水作用疏水層析中常用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉9（二）疏水層析3.疏水層析技術(shù)機(jī)制（2）影響疏水層析的因素②破壞水化作用的物質(zhì)③降低表面張力的化學(xué)物質(zhì)。表面活性劑可以與蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，減弱蛋白質(zhì)與固定相的疏水性吸附。難溶于水的膜蛋白可以添加一定量的表面活性劑使其溶解，有利于洗脫。加入乙二醇等多元醇可改變流動(dòng)相的表面張力，降低疏水作用，有利于層析展開(kāi)、洗脫。④pH。一般pH升高會(huì)使疏水作用減弱，而降低pH則可增加疏水作用。但是，一些等電點(diǎn)較高的蛋白質(zhì)，在高pH情況下會(huì)牢固地結(jié)合到固定相上，低pH有利于洗脫。⑤溫度。疏水吸附結(jié)合作用隨溫度升高而增大，降溫有利于洗脫。SCN-、ClO4-和I-等離子半徑較大、電荷密度低10（二）疏水層析4.疏水層析操作技術(shù)

疏水層析技術(shù)操作主要包括裝柱階段、平衡階段、上樣階段、洗滌階段、洗脫階段、清洗和再平衡階段。11（二）疏水層析洗脫：生產(chǎn)中主要采用降低鹽濃度的方法進(jìn)行洗脫。4.疏水層析操作技術(shù)（a）疏水層析線性梯度洗脫層析12（二）疏水層析洗脫：生產(chǎn)中主要采用降低鹽濃度的方法進(jìn)行洗脫。4.疏水層析操作技術(shù)（b）疏水層析階梯洗脫層析13（三）反相層析1.反相層析的應(yīng)用反相層析與疏水層析主要區(qū)別：疏水側(cè)鏈的長(zhǎng)度及其在介質(zhì)骨架上的密集程度不同，疏水層析的疏水性較弱，反相層析的疏水性較強(qiáng)。

反相層析常需要較高的操作壓力，需要加入有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)四級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化而變性，因此在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用受限。

適用于肽類、寡核苷酸等小分子，還可用于純化變性后可復(fù)性的重組、合成蛋白質(zhì)等，還可用于樣品濃縮、脫鹽。2.反相層析的介質(zhì)

反相層析介質(zhì)的疏水基團(tuán)密集程度比疏水層析介質(zhì)要高得多，并且常使用長(zhǎng)脂肪鏈如十八碳烷烴作為功能基，疏水性更強(qiáng)。疏水層析以八碳烷烴為主要代表，且密集程度小，使目的物能以較溫和條件純化。而反相層析中功能基團(tuán)的疏水性要比疏水層析固定相高幾十倍到幾百倍。14（三）反相層析

反相層析技術(shù)操作主要包括裝柱階段、平衡階段、上樣階段、洗滌階段、洗脫階段、清洗和再平衡階段。3.反相層析操作技術(shù)15（三）反相層析3.反相層析操作技術(shù)（1）裝柱階段

反相層析介質(zhì)裝填要致密、均勻、無(wú)氣泡，減少樣品流動(dòng)過(guò)程中的展寬，提高物質(zhì)分辨率。（2）平衡階段（5倍柱床體積）

起始緩沖液（標(biāo)識(shí)為：A溶液）一般為加入一定比例有機(jī)溶劑的水溶液，通常帶有三氟乙酸（TFA）等離子對(duì)試劑和離子效應(yīng)抑制劑來(lái)促進(jìn)疏水相互作用，還可加有低濃度有機(jī)修飾劑，如5%乙腈。（3）上樣階段

必要時(shí)，先采用凝膠層析柱，更換樣品緩沖溶液、脫鹽和除去低分子量雜質(zhì)后再上樣。

樣品溶解于起始平衡緩沖液。樣品需澄清，否則需用濾紙或5μm濾膜過(guò)濾，然后再采用10000g離心10min，或者0.22μm孔徑微孔濾膜過(guò)濾。

上樣量為層析劑介質(zhì)總結(jié)和能力的20%～25%。16（三）反相層析3.反相層析操作技術(shù)（4）洗滌階段

上樣后繼續(xù)用起始平衡緩沖液沖洗層析柱，至層析圖基線穩(wěn)定，液體用量約2倍柱床體積。（5）洗脫階段

增加有機(jī)修飾劑濃度，如逐漸提高乙腈濃度比例至80%B溶液，結(jié)合物被洗脫下來(lái)。疏水性弱的結(jié)合物先被洗脫下來(lái)，強(qiáng)的后被洗脫下來(lái)。（6）清洗和再平衡段①用至少5CV的100%B溶液沖洗--除去仍結(jié)合的分子②用2～3CV從100%B溶液到0%B溶液梯度--避免成分突然改變損壞柱子③用至少10CV起始緩沖液--再平衡如有難以清洗的結(jié)合物，可考慮改換用疏水層析。17（四）有機(jī)溶劑安全1.使用有機(jī)溶劑存在的隱患12345易揮發(fā)引起火災(zāi)或爆炸過(guò)量?jī)?chǔ)存或儲(chǔ)存不當(dāng)通風(fēng)排氣系統(tǒng)不符合要求使用非防爆電氣設(shè)備有機(jī)溶劑致人員中毒！18（四）有機(jī)溶劑安全2.有機(jī)溶劑安全使用技能（1）有機(jī)溶劑的儲(chǔ)存容器應(yīng)盡可能密閉，杜絕跑冒滴漏，減少揮發(fā)氣體散發(fā)，盡量防止外部空氣進(jìn)入設(shè)備容器內(nèi)形成爆炸性氣體混合物。（2）車間與倉(cāng)庫(kù)需設(shè)置消除靜電設(shè)施，并使用防爆燈具、電氣開(kāi)關(guān)。（3）加強(qiáng)環(huán)境通風(fēng)換氣，對(duì)車間實(shí)行全面通風(fēng)，合理設(shè)置排風(fēng)設(shè)備，有效降低環(huán)境內(nèi)有機(jī)溶劑氣體的濃度。（4）專門(mén)的倉(cāng)庫(kù)內(nèi)存儲(chǔ)有機(jī)溶劑，避免日光直射和高溫環(huán)境，遠(yuǎn)離火源和氧化劑。（5）以低毒（無(wú)毒）溶劑替代高毒（低毒）溶劑，對(duì)使用易燃易爆物崗位設(shè)立應(yīng)急報(bào)警裝置和應(yīng)急救援設(shè)施。19（四）有機(jī)溶劑安全2.有機(jī)溶劑安全使用技能（6）熟讀化學(xué)品安全技術(shù)說(shuō)明書(shū)（MSDS），采取有針對(duì)性的安全措施。MSDS在國(guó)際上稱作化學(xué)品安全信息卡，是化學(xué)品生產(chǎn)商和經(jīng)銷商按法律要求必須提供的化學(xué)品理化特性（如pH值，閃點(diǎn)，易燃度，反應(yīng)活性等）、毒性、環(huán)境危害、以及對(duì)使用者健康（如致癌，致畸等）可能產(chǎn)生危害的一份綜合性文件。20任務(wù)實(shí)施人干擾素α2b的疏水層析12345生產(chǎn)前準(zhǔn)備裝柱67平衡上樣洗脫再生清場(chǎng)211.確認(rèn)與填寫(xiě)檢查記錄

確認(rèn)是否有前批清場(chǎng)合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具是否符合要求。填寫(xiě)發(fā)酵液中菌體的處理產(chǎn)前檢查記錄。2.領(lǐng)料與溶液配制領(lǐng)取生產(chǎn)用試劑耗材物料并配液：（1）平衡液：1mol/L硫酸銨的pH4.5，20mmol/LHAc-NaAc溶液。（2）洗脫液：含0.03mmol/L硫酸銨的pH4.5，100mmol/LHAc-NaAc溶液。（一）生產(chǎn)前準(zhǔn)備22（二）裝柱

如未裝柱，則按標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將OctylSepharose4FF進(jìn)行裝柱，如已裝好柱，則可順序進(jìn)行如下操作。23（1）洗脫，洗脫液流速為30.0mL/min，收集OD280＞0.2洗脫峰。（2）測(cè)量收集液OD280、OD260之值，比值應(yīng)大于1.70。（3）目標(biāo)蛋白純度應(yīng)＞95%，并計(jì)算收率。（4）洗脫液進(jìn)行凝膠層析或于4℃放置不超過(guò)96h。（五）洗脫（1）預(yù)熱紫外檢測(cè)儀及記錄儀，30min。（2）注射用水中，流速為30.0mL/min，沖洗3倍柱床體積。（3）平衡液平衡3倍柱床體積，至流出pH為4.5～5.0。（三）平衡（1）樣品預(yù)處理。在DEAE柱洗脫液中加入硫酸銨，使硫酸銨終濃度為1mol/L，靜置半小時(shí)以上。（2）上樣。以30.0mL/min流速上樣。上樣后，用平衡液平衡2倍柱床體積。流速為30.0mL/min。（四）上樣24（七）清場(chǎng)

檢查、整理各項(xiàng)記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺(tái)和潔凈室。最后，填寫(xiě)清場(chǎng)合格證。注意：請(qǐng)?jiān)谌蝿?wù)實(shí)施過(guò)程中規(guī)范填寫(xiě)《人干擾素α2b疏水層析操作記錄》，不可補(bǔ)填和篡改?。?）將進(jìn)液管換至注射用水中，調(diào)節(jié)泵流速為30.0mL/min，洗脫2倍柱床體積。（2）將進(jìn)液管換至0.5mol/LNaOH清潔液中，調(diào)節(jié)泵流速為30.0mL/min，洗脫2倍柱床體積。（3）關(guān)閉泵、出液端夾子、記錄儀和紫外檢測(cè)儀。（六）再生25知識(shí)學(xué)習(xí)反思與反饋學(xué)習(xí)成果實(shí)踐操作考核與評(píng)價(jià)26拓展任務(wù)疏水層析法純化蛋白質(zhì)27查閱資料，結(jié)合生活常識(shí)了解雞蛋清組成及性質(zhì)。查閱設(shè)計(jì)《疏水層析法純化蛋白質(zhì)操作記錄》，在任務(wù)實(shí)施過(guò)程中同步填寫(xiě)。取雞蛋蛋清，鹽析法分別制得蛋白質(zhì)溶液，再用疏水層析法分離蛋白組分，并檢測(cè)分離的效果。設(shè)計(jì)實(shí)操設(shè)計(jì)（一）任務(wù)描述28（二）實(shí)訓(xùn)材料1.材料、試劑新鮮雞蛋、上樣緩沖液（20mmol/L，pH7.0磷酸鈉鹽，50％硫酸銨溶液）、硫酸銨。2.儀器設(shè)備5mLHiTrapPhenylHP預(yù)裝層析柱（預(yù)填充有5mLPhenylSepharose6FF填料）、5mL注射器、50mL注射器或?qū)游鱿到y(tǒng)、高速冷凍離心機(jī)、0.22μm濾膜與濾器、紫外分光光度計(jì)。29（三）實(shí)訓(xùn)操作生產(chǎn)前準(zhǔn)備樣品的制備疏水層析柱平衡蛋白質(zhì)溶液上樣層析柱的洗滌蛋白質(zhì)組分的洗脫層析柱的清洗與再生層析柱的保存12345678檢測(cè)和分析910清場(chǎng)30（四）任務(wù)分析與總結(jié)（1）任務(wù)中采用的Hi