丹紅注射液通過調(diào)控SATB1/SLC7A11/GPX4通路抑制腦缺血損傷中的鐵死亡中文摘要目的：本文的選題目的是探究丹紅注射液（DanhongInjection，DHI）在腦缺血過程中鐵死亡進(jìn)程的作用。缺血性腦卒中具有高死亡率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率的特點(diǎn)。目前除了在缺血后較窄時間窗內(nèi)使用的溶栓治療手段，臨床上還缺乏療效滿意的治療藥物。目前，鐵死亡被發(fā)現(xiàn)是缺血性腦卒中治療的關(guān)鍵切入點(diǎn)。故本課題基于前期研究基礎(chǔ)，進(jìn)一步考察了丹紅注射液調(diào)控的特殊的富含AT序列結(jié)合蛋白1（SpecialAT-richsequencebindingprotein1，SATB1）對腦缺血損傷中鐵死亡的作用，探討其在治療腦缺血等相關(guān)疾病中的潛力，既能闡明丹紅注射液治療缺血性腦卒中的新病理機(jī)制，又為尋找有效的藥物作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。方法：建立雄性C57BL/6小鼠的永久性腦缺血模型（pMCAO），利用免疫印跡技術(shù)（Westernblot）測定SATB1在術(shù)后不同時間點(diǎn)（3h，6h，12h）的表達(dá)水平，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的時間點(diǎn)。之后進(jìn)行為期4天的丹紅注射液預(yù)防給藥，建立pMCAO模型，利用行為學(xué)測定評估神經(jīng)缺陷，TTC染色測定腦梗死面積，H&E及尼氏染色考察腦缺血損傷后的病理損傷情況，同時利用免疫熒光技術(shù)分析丹紅注射液對腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞中SATB1蛋白的調(diào)控作用。之后，利用普魯士藍(lán)染色觀察鐵離子的蓄積、利用透射電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)變化，驗(yàn)證丹紅注射液對永久性腦缺血中鐵死亡的改善作用，結(jié)合Westernblot分析鐵死亡及相關(guān)通路蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：通過建立不同時間點(diǎn)的pMCAO模型，發(fā)現(xiàn)SATB1的表達(dá)水平逐漸降低，結(jié)合腦卒中急性治療的時間窗，確定梗死時間6h為最佳時間點(diǎn)并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。此外，在丹紅注射液給藥后，pMCAO小鼠的腦梗死面積減少（p＜0.05），神經(jīng)行為學(xué)障礙得到改善，并減少了腦皮層組織中神經(jīng)細(xì)胞的死亡（p＜0.05），同時丹紅注射液能夠提高SATB1在pMCAO小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)水平（p＜0.01），這提示了丹紅注射液對永久性腦缺血小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，丹紅注射液改善了pMCAO小鼠腦組織中鐵離子積蓄、線粒體的特征性壞死的情況。結(jié)合Westernblot結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在丹紅注射液給藥后，小鼠腦組織中特征性抗鐵死亡標(biāo)志物FtH1和HO-1的表達(dá)上調(diào)（p＜0.01），鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TF和TfR1水平下調(diào)（p＜0.05），并激活了SATB1/SLC7A11/GPX4鐵死亡信號通路，抑制了腦缺血損傷中的鐵死亡進(jìn)程。結(jié)論：本課題發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能夠通過調(diào)控SATB1/SLC7A11/GPX4通路，抑制永久性腦缺血過程中的鐵死亡，從新的角度揭示了丹紅注射液對腦缺血損傷的作用。關(guān)鍵詞：丹紅注射液；缺血性腦卒中；鐵死亡；SATB1。DanhonginjectionregulatestheSATB1/SLC7A11/GPX4pathwaybyinhibitingtheferroptosisduringcerebralischemiaABSTRACTObjective:ThepurposeofthisarticleistoexploretheroleofDanhongInjection(DHI)ontheprocessofferroptosisduringcerebralischemia.Ischemicstrokeprocessesthecharacteristicsofhighmortalityrate,highrecurrencerate,andhighdisabilityrate.Atpresent,thereisalackofclinicallysatisfactorytherapeuticdrugsexpectthethrombolytictherapyusedwithinanarrowtimewindowafterischemia,.Atpresent,ferroptosishasbeenfoundtobeakeypointforthetreatmentofischemicstroke.Basesonthepreviousresearch,thisstudyinvestigatedtheeffectofSpecialATrichsequencebindingprotein1(SATB1)regulatedbyDanhongInjection(DHI)onferroptosisincerebralischemia.ThisstudyaimstoelucidatethenewpathologicalmechanismofDanhongInjectionintreatingischemicstrokeandbuildupthefoundationforfindingtheeffectivedrugtarget.Methods:Byestablishingthepermanentcerebralarteryocclusion(pMCAO)inmaleC57BL/6mice,weuseWesternblottomeasuretheexpressionlevelofSATB1atdifferentpostoperativetimepoints(3h,6h,12h)toscreentheoptimaltimepointforsubsequentexperiment.Then,a4-dayprophylacticadministrationofDanhonginjectionwasconductedandestablishedthepMCAOmodel.Behavioralmeasurementswereusedtoevaluateneuraldefects,TTCstainingwasusedtomeasuretheareaofcerebralinfarction,H&EandNisslstainingwereusedtoinvestigatethepathologicaldamageafterpMCAOinjury.Atthesametime,immunofluorescencewasusedtoanalyzetheregulatoryeffectofDanhonginjectionontheSATB1proteininneuralcellsinthebrain.Atthesametime,prussianbluestainingwasusedtoobservetheaccumulationofironions,andtransmissionelectronmicroscopywasusedtoobservetheultrastructuralchangesofmitochondriawhichverifiedtheeffectofDanhonginjectiononferroptosisinpermanentcerebralischemia.Finally,Westernblotwasusedtoanalyzetheexpressionofferroptsis-relatedproteins.Results：ByestablishingpMCAOmodelatdifferenttimepoints,itwasfoundthattheexpressionlevelofSATB1graduallydecreased.Accordingtothetimewindowofacutestroke,theoptimaltimepointwasdeterminedtobe6handusedforsubsequentexperiment.Inaddition,aftertheadministrationofDHI,theinfarctareaofpMCAOmicedecreased(p<0.05),theneuroethologydisorderwasimproved,andthedeathofnervecellsinthecerebralcortexwasreduced(p<0.05).Atthesametime,DHIadministrationcouldincreasetheexpressionlevelofSATB1inthebrainneuronsofpMCAOmice(p<0.01),whichsuggestedtheneuroprotectiveeffectofDanhonginjectiononpMCAOmice.Inaddition,italsoimprovedtheaccumulationofironionsandcharacteristicmitochondrialnecrosisinthebraintissueofpMCAOmice.AccordingtotheresultsofWesternblot,itwasfoundthattheexpressionoftheFtH1wasupregulated(p<0.01),thelevelsofironiontransportersTFandTfR1weredownregulated(p<0.05),andtheSATB1/SLC7A11/GPX4ferroptosissignalingpathwaywasactivatedafterDHIadministrationwhichinhibitedtheprocessofferroptosis.Conclusion:ThisstudysuggesedthatDanhongInjectioncaninhibitferroptosisduringpermanentcerebralischemiabyregulatingtheSATB1/SLC7A11/GPX4pathway,whichrevealedtheeffectofDanhongInjectiononcerebralischemiainjuryfromanewperspective.Keywords:Danhonginjection;Ischemicstroke;Ferroptosis;SATB1。

目錄TOC\o"1-3"\h\u301前言 前言缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重殘疾和死亡的主要疾病之一，約占腦卒中病例的80%。缺血性腦卒中是由于腦血管的堵塞，致使氧氣和葡萄糖等物質(zhì)運(yùn)輸?shù)募毙灾袛?，造成腦組織細(xì)胞的死亡[1]。由于人口老齡化以及腦卒中治療時間窗的限制，臨床上目前仍然缺乏安全有效的治療藥物。重組人組織型纖溶酶原激活劑（rt-PA）是FDA批準(zhǔn)的唯一治療急性缺血性中風(fēng)的藥物。然而，由于rt-PA治療具有腦出血等嚴(yán)重的并發(fā)癥，在臨床應(yīng)用上有嚴(yán)格的限制條件，故目前臨床上仍缺乏安全有效的治療藥物[2]。所以，針對缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制，尋找具有治療作用的藥物并闡明其作用機(jī)制具有重要的意義。丹紅注射液（Danhonginjection,DHI）是由丹參和紅花組成的標(biāo)準(zhǔn)化注射劑，廣泛用于心腦血管疾病的治療[3]。多項研究表明，丹紅注射液對腦卒中有保護(hù)作用。在治療150例腦卒中患者時，丹紅注射液可以顯著改善患者的血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血功能，從而有效延緩血栓形成[4]。此外，對腦缺血再灌注大鼠的研究顯示，丹紅注射液具有良好的抗氧化活性，可以改善腦組織中的氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙，進(jìn)而有效縮小梗死面積。值得注意的是，這些作用機(jī)制都與鐵死亡有關(guān)[5]。鐵死亡是一種特殊的細(xì)胞死亡方式，具有非凋亡性，鐵依賴性的特點(diǎn)，通常會導(dǎo)致脂質(zhì)過度氧化物的過度累積，造成細(xì)胞的氧化性死亡，并在腫瘤、神經(jīng)退行性疾病以及缺血性腦損傷過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[6]。鐵死亡的發(fā)生通常伴隨著獨(dú)特的形態(tài)和生化特征變化。在形態(tài)學(xué)變化上，鐵死亡造成線粒體體積的萎縮，外膜破裂，嵴減少，內(nèi)膜壓縮等變化；在生化特征上，鐵死亡造成鐵離子含量超載和脂質(zhì)過氧化物的累積，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）作為鐵死亡的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子之一，已被揭示能夠驅(qū)動鐵死亡抗性，在缺血性腦卒中等疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[8]。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4），作為抗氧化損傷的關(guān)鍵因子，與鐵死亡的進(jìn)程密切相關(guān)。在腦缺血損傷過程中，谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶的合成活性受到抑制，產(chǎn)生大量活性氧，從而致使腦細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡的現(xiàn)象[9]。已有研究表明，SLC7A11的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胱氨酸水平降低，造成谷胱甘肽（GSH）的生物合成降低，從而抑制GPX4活性，加劇鐵死亡的進(jìn)程[10]。基于前期研究，我們在和蛋白質(zhì)組學(xué)中，利用丹紅注射液在永久性腦缺血小鼠模型中篩選出關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子SATB1[11]。已有研究表明，SATB1基因的表達(dá)對氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定調(diào)節(jié)作用[12]，在滋養(yǎng)層細(xì)胞中，氧化應(yīng)激的損傷伴隨著SATB1表達(dá)水平的下調(diào)，而上調(diào)其表達(dá)水平能夠恢復(fù)腫瘤中滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長[ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Rao</Author><Year>2018</Year><RecNum>295</RecNum><DisplayText>[19]</DisplayText><record><rec-number>295</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675088223">295</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Rao,H.Y.</author><author>Bai,Y.X.</author><author>Li,Q.S.</author><author>Zhuang,B.M.</author><author>Yuan,Y.</author><author>Liu,Y.M.</author><author>Peng,W.</author><author>Baker,P.N.</author><author>Tong,C.</author><author>Luo,X.</author><author>Qi,H.B.</author></authors></contributors><titles><title>SATB1downregulationinducedbyoxidativestressparticipatesintrophoblastinvasionbyregulatingbeta-catenin</title><secondary-title>BiologyofReproduction</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiologyofReproduction</full-title><abbr-1>Biol.Reprod.</abbr-1><abbr-2>BiolReprod</abbr-2></periodical><pages>810-820</pages><volume>98</volume><number>6</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>0006-3363</isbn><accession-num>WOS:000446326300008</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000446326300008</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1093/biolre/ioy033</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>13]。SATB1是一種核基質(zhì)相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，參與染色質(zhì)重塑。SATB1在成熟神經(jīng)元細(xì)胞中高度表達(dá)，主要表達(dá)在大腦皮質(zhì)，下丘腦與海馬等區(qū)域，與神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞功能具有密切關(guān)系[14]。但目前對于SATB1在腦卒中過程中的作用仍不明確，且缺少深入的研究。2實(shí)驗(yàn)材料2.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級雄性C57BL/6小鼠，周齡6-7周，體重15-20g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心。小鼠在飼養(yǎng)在SPF環(huán)境，提供充足的飼料和水，并進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，動物實(shí)驗(yàn)倫理已通過廣東藥科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的批準(zhǔn)，動物實(shí)驗(yàn)編號為：SPF2017416。2.2藥品與試劑表2-1主要藥品與試劑藥品/試劑名稱生產(chǎn)廠家/貨號丹紅注射液制劑山東步長制藥公司依達(dá)拉奉A(yù)lorich/M70800異氟烷玉研生物/s100105332%TTC染色液Solarbio/G3005PBS緩沖液（pH7.4）Corning/210400674%多聚甲醛通用型組織固定液Biosharp/BL539AHE染液Servicebio/G1005尼氏染液Servicebio/G1036甲醇致遠(yuǎn)RIPA裂解液MCE/HYK0010蛋白酶抑制劑MCE/HYK0022磷酸酶抑制劑Thermo/23227BCA蛋白定量試劑盒Thermo/232275×蛋白上樣緩沖液生工生物工程有限公司/C506032-0005蛋白預(yù)染MarkerThermo/266164×Tris-HCl/SDS緩沖液（pH6.8）生工生物工程有限公司/B546022-02504×Tris-HCl/SDS緩沖液（pH8.8）生工生物工程有限公司/B546021-0250TEMED碧云天/ST7728APSsubstitute碧云天/ST005SDS碧云天/ST627Glycine/甘氨酸碧云天/ST085Tris（ElectrophoresisGrade）碧云天/ST760脫脂奶粉美國BD公司/CND07-F0500EZ-BuffersH10×TBSTBuffer生工生物工程有限公司/C520009-0500一抗稀釋液碧云天/P002A二抗稀釋液碧云天/P0258DAPI染色液Servicebio/G1012PVDF膜MILLIPORE/PRO4575GAPDHantibodyPTG/60041-1-lgSATB1antibodyAbcam/ab109122NeunantibodyServicebio/G11138GoatAnti-RabbitlgG(H+L)PTG/SA00001-2Goatanti-MouseIgG(H+L)PTG/SA00001-1電鏡固定液Servicebio/G1102p-SATB1antibodySAB/13538SLC7A11antibodyAbcam/ab175186HO-1antibodyPTG/27282-1-lgGPX4antibodyPTG/67763-1-lgTFR1antibodyAbmart/T56618FTH1antibodyAbmart/T55648TFantibodyPTG/17435-1-APTubulinantibodyPTG/10068-1-lgBeta-actinantibodyPTG/67763-1-lg2.3儀器與耗材表2-2主要儀器與耗材儀器與耗材名稱生產(chǎn)廠家/貨號1mL移液槍ThermoScientific200μL移液槍ThermoScientific100μL移液槍ThermoScientific20μL移液槍ThermoScientific2.5μL移液槍ThermoScientific酶標(biāo)儀美國BIO-RAD伯樂低溫高速離心機(jī)SiGMA/TDL-80-2B-80℃超低溫冰箱Haier雪花制冰機(jī)XUEKE電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司/DHG-9070A恒溫水浴鍋上海一恒科學(xué)儀器有限公司液氮罐Haier/YDS-65-216-FZ小鼠腦膜具上海玉研科技儀器有限公司小鼠MCAO線栓廣州佳靈生物技術(shù)有限公司手術(shù)器械等上海玉研科技儀器有限公司垂直電泳槽美國BIO-RAD伯樂電泳儀電源美國BIO-RAD伯樂搖床SCILOGEX/SK-L180-E超聲波細(xì)胞粉碎儀寧波新芝生物科技股份有限公司/JY92-IIN化學(xué)發(fā)光成像儀北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司3實(shí)驗(yàn)方法3.1藥物的配置丹紅注射液（Danhonginjection，DHI）的配制：丹紅注射液為中藥注射劑，每次給藥前選擇未開封的試劑，現(xiàn)開現(xiàn)用。依達(dá)拉奉溶液（Edaravone）：稱取適量依達(dá)拉奉粉末，用生理鹽水配置成母液，終濃度為1mg/ml現(xiàn)配現(xiàn)用。3.2動物分組及給藥飼養(yǎng)周齡為8-10周的C57小鼠達(dá)到20-25g，將其隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組20只（Sham），模型組20只（Model），丹紅注射液高劑量組20只（DHI-L，5ml/kg），丹紅注射液低劑量組10只（DHI-L，2.5ml/kg），依達(dá)拉奉陽性藥組（Edaravone，6mg/kg）。每日腹腔注射給藥一次一共給藥4次，假手術(shù)組和模型組按照5ml/kg的比例腹腔注射生理鹽水，第四天在腹腔注射給藥后1h開始造模。3.3小鼠pMCAO模型的建立基于Zea-Longa法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Longa</Author><Year>1989</Year><RecNum>307</RecNum><DisplayText>[59]</DisplayText><record><rec-number>307</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675260197">307</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Longa,E.Z.</author><author>Weinstein,P.R.</author><author>Carlson,S.</author><author>Cummins,R.</author></authors></contributors><titles><title>Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats</title><secondary-title>Stroke</secondary-title></titles><periodical><full-title>Stroke</full-title><abbr-1>Stroke</abbr-1><abbr-2>Stroke</abbr-2></periodical><pages>84-91</pages><volume>20</volume><number>1</number><dates><year>1989</year><pub-dates><date>1989</date></pub-dates></dates><isbn>0039-2499</isbn><accession-num>MEDLINE:2643202</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://MEDLINE:2643202</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1161/01.Str.20.1.84</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[15]，將健康雄性小鼠（體重在25g左右）禁食12h后，用異氟烷進(jìn)行氣體麻醉，在整個手術(shù)過程中保持深度麻醉的狀態(tài)。將動物固定，然后沿頸部中線切開，露出頸部\o"LearnmoreaboutrightcommoncarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"右頸總動脈(CCA)、\o"LearnmoreaboutexternalcarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"頸外動脈(ECA)和\o"LearnmoreaboutinternalcarotidarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"頸內(nèi)動脈(ICA)。在解剖時應(yīng)注意避免在解剖過程中損傷迷走神經(jīng)、CCA和ECA。然后將符合小鼠體重區(qū)間的線栓插入ICA中，并輕輕推進(jìn)直到線栓在ICA內(nèi)有輕微阻力以封閉\o"LearnmoreaboutmiddlecerebralarteryfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"大腦中動脈。在假手術(shù)組中不插入線栓，其余的操作與模型組及給藥組相同。缺血的時間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡男枰?，進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計。3.4行為學(xué)評分基于Zea-Longa法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sasaki</Author><Year>2009</Year><RecNum>306</RecNum><DisplayText>[60]</DisplayText><record><rec-number>306</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675260116">306</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sasaki,Masanori</author><author>Honmou,Osamu</author><author>Kocsis,JefferyD.</author></authors></contributors><titles><title>Aratmiddlecerebralarteryocclusionmodelandintravenouscellulardelivery</title><secondary-title>Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.)</secondary-title></titles><periodical><full-title>Methodsinmolecularbiology(Clifton,N.J.)</full-title></periodical><pages>187-95</pages><volume>549</volume><dates><year>2009</year><pub-dates><date>2009</date></pub-dates></dates><isbn>1064-3745</isbn><accession-num>MEDLINE:19378204</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://MEDLINE:19378204</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/978-1-60327-931-4_13</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[16]，在術(shù)后6h后，進(jìn)行行為學(xué)評分，評分細(xì)則見表3-1。評分時由三名實(shí)驗(yàn)人員分開進(jìn)行評分，采用雙盲法在空曠且安靜的地方進(jìn)行，最終的行為學(xué)評分結(jié)果為三位實(shí)驗(yàn)人員評分的均值。表3-1小鼠神經(jīng)功能癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)分?jǐn)?shù)行為表現(xiàn)0無明顯神經(jīng)功能障礙1右前肢伸直障礙2右前肢有阻礙，行走時偏向右側(cè)3原地右側(cè)旋轉(zhuǎn)4完全右癱3.5樣品收集及處理經(jīng)過pMCAO造模后，深度麻醉小鼠并進(jìn)行生理鹽水的心臟灌流，取出大腦并將小腦、腦干和嗅球等部位進(jìn)行分離，針對不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行不同的處理。進(jìn)行藥效指標(biāo)的測定和免疫印跡的樣本，需要使用手術(shù)刀將左右腦分開。對于使用TTC染色的樣品，則需要保留全腦。而用于組織學(xué)檢測的樣品需要使用多聚甲醛進(jìn)行固定，并冷藏保存。3.6免疫印跡技術(shù)（Westernblot）分析目標(biāo)蛋白的差異表達(dá)取梗死側(cè)半腦組織，加入鋼珠進(jìn)行組織勻漿，同時加入RIPA裂解液、\o"LearnmoreaboutproteasefromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"蛋白酶和\o"LearnmoreaboutphosphatasefromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"磷酸酶抑制劑（98:1:1）,在冰上靜置30min，然后使用低溫高速離心機(jī)進(jìn)行離心（12000rpm，4℃，10min），取出上清液后分裝備用。使用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量，變性后保存﹣20℃。將分子量指示劑Marker和樣本分別加入到SDS膠的泳道內(nèi)，進(jìn)行電泳，結(jié)束之后進(jìn)行電轉(zhuǎn)到活化的PVDF膜，根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量剪膜后，在5%的脫脂牛奶中封閉1.5h，后續(xù)利用一抗稀釋液配置目標(biāo)蛋白的一抗溶液，完全覆蓋PVDF膜，放入4℃過夜，隔天進(jìn)行溶液的回收后使用TBST溶液清洗5次，之后即可加入對應(yīng)種屬的二抗溶液，在室溫下孵育1.5h，之后同樣用TBST溶液清洗5次，即可使用化學(xué)成像發(fā)光儀和ECL發(fā)光液將條帶顯影成像，之后使用ImageJ軟件統(tǒng)計灰度值。3.7TTC染色法測定腦梗死面積首先，將“3.5”中取材的大腦放入小鼠腦模具中，然后將其放入-20℃的環(huán)境中冷凍15min。之后用手術(shù)刀片將大腦切成連續(xù)的1mm厚度的冠狀段，并在37℃的0.5%TTC中孵育10min，適當(dāng)翻面保證染色均勻。完成染色后，將樣品固定在多聚甲醛中以便更好地成像。正常的腦組織經(jīng)過染色后呈現(xiàn)紅色，而梗死區(qū)域則呈現(xiàn)白色。采用ImageJ軟件（ImageJ1.4,NIH,UnitedStates）按照以下公式計算腦梗死體積：梗死面積（%）=（梗死面積/全腦面積）×100%。3.8小鼠腦組織切片制備和染色3.8.1石蠟切片制作取“3.5”中取材后固定的腦組織，制成4μm左右厚度的石蠟切片，剩余腦組織利用石蠟包埋，置于室溫備用，為保證最佳實(shí)驗(yàn)效果，需盡量在3個月內(nèi)使用。3.8.2H&E染色取制備好石蠟切片脫蠟，用蘇木精染色3-5min，用流水洗滌后使用分化液分化，雙蒸水再次浸洗后反藍(lán)。將切片用1%伊紅染色5min后水洗，在濃度遞減的乙醇中脫水，并在二甲苯中澄清。最后，用中性樹脂固定切片，使用掃描儀采集圖像并分析。3.8.3尼氏（Nissl）染色取制備好石蠟切片脫蠟后水洗，用尼氏染色溶液染色3min。用蒸餾水洗滌腦切片后使用0.1%的冰醋酸分化。脫水處理后使用中性樹脂固定切片，使用掃描儀采集圖像并分析。3.8.4組織免疫熒光染色將切片浸入EDTA抗原修復(fù)緩沖液（PH8.0）中，在微波中加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，期間注意防止EDTA緩沖液過度蒸發(fā)導(dǎo)致干片的情況。冷卻至室溫后，將切片放置于PBS溶液，晃動洗滌三次并甩干后，用3%的過氧化氫溶液避光孵育25min以封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，再重復(fù)PBS洗滌的步驟。之后用1%牛血清白蛋白孵育以阻斷非特異性結(jié)合。切片與一抗孵育在4℃過夜，之后置于PBS溶液內(nèi)，在搖床中晃動洗滌三次。孵育對應(yīng)種屬的二抗在室溫孵育1h。PBS洗滌之后，再加入DAPI進(jìn)行細(xì)胞核復(fù)染色，避光孵育10min再進(jìn)行PBS洗滌，后略微甩干用抗熒光猝滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察并使用掃描儀采集圖像并分析。3.8.5DAB加強(qiáng)法的普魯士藍(lán)染色將各組的石蠟切片脫蠟至水，將切片浸入2%亞鐵氰化鉀和2%鹽酸等比例混合溶液內(nèi)，染色30min后用蒸餾水清洗2次。之后繼續(xù)用DAB顯色液滴染5-10min，之后除去染液后并用蒸餾水清洗3次。再使用蘇木素對細(xì)胞核進(jìn)行染色，水洗后使用鹽酸水溶液分化和氨水水溶液返藍(lán)，再次水洗后進(jìn)行封片，即可進(jìn)行顯微鏡的鏡檢和掃片處理。3.9透視電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)收集腦組織樣品后，保存于在電鏡專用的固定液中，于4℃過夜，從小鼠的缺血半暗帶獲得1mm3立方體的組織塊，保存于固定液內(nèi)進(jìn)行送樣。之后經(jīng)過一系列的漂洗程序和不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理，然后，用超薄切片機(jī)（LEICAEMUC7）切割包埋于環(huán)氧樹脂內(nèi)的樣品，制成70-90nm的切片,用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行染色后水洗風(fēng)干，用電子透射顯微鏡進(jìn)行觀察線粒體，拍攝其超微圖像。3.10數(shù)據(jù)處理采用GraphpadPrism8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，在多組別樣本實(shí)驗(yàn)中，采用單因素方差分析，p<0.05表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義；后續(xù)使用Graphpad和Photoshop軟件作圖。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1pMCAO后SATB1表達(dá)水平的動態(tài)變化如圖4-1和4-2所示，我們用Westernblot考察了SATB1的表達(dá)水平在pMCAO造膜時間為3h，6h，12h的三個不同的時間點(diǎn)的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SATB1在3h時的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性變化，但是在6h，12h的時間點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生了顯著性的降低（p<0.01），尤其是在6h的時間點(diǎn)，這提示我們SATB1在腦卒中急性治療時間窗內(nèi)的潛在作用。圖4-1不同pMCAO造膜時間下SATB1蛋白的代表性圖。圖4-2不同pMCAO造膜時間下SATB1蛋白的定量。注：n=3，與sham組比較，##p<0.01；ns，沒有顯著性差異。4.2丹紅注射液減少小鼠pMCAO損傷的腦梗面積如圖4-3和圖4-4所示，Sham組腦組織沒有梗死情況，TTC染色后腦切片呈現(xiàn)紅色，與Sham組相比，Model組的腦組織切片出現(xiàn)明顯的白色梗死區(qū)域，腦梗死面積為32.4±3.14%，尼莫地平陽性藥組能夠明顯改善梗死面積（p＜0.01），證明建立模型成功。丹紅注射液高（DHI-H）、低劑量組(DHI-L)給藥后縮小腦梗面積的效果顯著（p<0.01），其中效果更佳的是高劑量組，梗死面積縮小至18.8±4.22%，而低劑量組為25.18±4.04%。、圖4-3DHI各劑量給藥后小鼠大腦的TTC染色代表圖。圖4-4DHI各劑量給藥后小鼠腦梗死面積的統(tǒng)計。注：n≥5，與sham組比較，##p<0.01，與model組比較；**p<0.01。4.3丹紅注射液改善小鼠pMCAO損傷造成的神經(jīng)行為學(xué)障礙采用Longa法，測定小鼠pMCAO術(shù)后的行為學(xué)表現(xiàn)，神經(jīng)缺陷越嚴(yán)重則評分越高。如圖4-5所示，Model組的小鼠出現(xiàn)原地轉(zhuǎn)圈，甚至偏癱等行為學(xué)障礙，表明其神經(jīng)功能受損嚴(yán)重。而相比之下Sham組的小鼠行動正常，無明顯行為學(xué)障礙。丹紅注射液及尼莫地平給藥后，對比model組的小鼠，其行為障礙均有改善（p<0.05）。圖4-5DHI各劑量給藥后小鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果注：n=8，與sham組比較，#p<0.05；與model組比較，*p<0.05。4.4丹紅注射液對pMCAO后腦組織病理損傷的保護(hù)作用根據(jù)“4.2”結(jié)果，丹紅注射液高劑量組改善腦梗死的效果最佳，因此選擇該組別進(jìn)行腦組織的病理損傷分析。4.4.1H&E染色結(jié)果如圖4-6所示，Model組的腦組織切片顯示造模后腦組織細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重壞死，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞核固縮，表示腦組織損傷嚴(yán)重。DHI給藥組則改善了上述現(xiàn)象。圖4-6圖4-6小鼠腦組織H&E染色結(jié)果。（n=3）注：40×，標(biāo)尺為20μm。4.4.2Nissl染色結(jié)果如圖4-7和圖4-8所示，Nissl染色的結(jié)果顯示，在Model組小鼠的大腦皮層中Nissl陽性神經(jīng)元的數(shù)量較少，且細(xì)胞間隙較寬。相比之下，在DHI給藥后小鼠大腦皮層中Nissl陽性神經(jīng)元的數(shù)量增多，尼氏小體更加清晰，受損程度減弱，其形態(tài)和排列也都與Sham組正常形態(tài)相似，表明DHI改善了腦卒中損傷造成的神經(jīng)元損傷。圖4-7小鼠腦組織Nissl染色結(jié)果。（n=3）注：40×，標(biāo)尺為20μm。圖4-8各組的Nissl陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計結(jié)果。（n=3）注：n=3，與sham組比較，#p<0.01，與model組比較，*p<0.05。4.5丹紅注射液對于SATB1表達(dá)水平的調(diào)控作用如圖4-9和圖4-10所示，通過觀察腦組織切片的免疫熒光結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)Sham組幾乎全部的NeuN陽性神經(jīng)元都與SATB1強(qiáng)烈共定位。pMCAO后，大腦皮層中共定位的神經(jīng)元顯著減少，這表明神經(jīng)元細(xì)胞在術(shù)后的丟失增加，SATB1在神經(jīng)元細(xì)胞的表達(dá)顯著降低（p<0.01），上訴情況在DHI處理后得到了顯著性的改善（p<0.01）。圖4-9小鼠腦組織SATB1免疫熒光染色結(jié)果。（n=3）圖4-10小鼠腦組織中，各組SATB1和NeuN共定位細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計。（n=3）4.6丹紅注射液抑制小鼠pMCAO損傷的鐵死亡4.6.1DAB加強(qiáng)法普魯士藍(lán)染色結(jié)果如圖4-11所示，根據(jù)普魯士藍(lán)染色結(jié)果，我們觀察到與Sham組相比，Model組小鼠的梗死腦組織呈現(xiàn)出明顯的棕黃色，這表明鐵離子在該區(qū)域積累嚴(yán)重。然而，在DHI處理后，梗死腦組織的鐵離子積累情況顯著得到改善。圖4-11小鼠腦組織普魯士藍(lán)染色結(jié)果。（n=3）注：40×，標(biāo)尺為20μm。4.6.2透視電鏡觀察線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變是鐵死亡的基本特征之一。我們使用透射電鏡觀察了各組小鼠腦組織中線粒體的形態(tài)學(xué)變化，如圖4-12所示，Model組的線粒體形態(tài)出現(xiàn)了膜破裂增加、線粒體嵴缺失或減少及體積減小等鐵死亡特征性壞死表現(xiàn)。而在DHI處理后，線粒體的結(jié)構(gòu)更加完整，破裂受損的線粒體數(shù)量也有所減少。圖4-12小鼠腦組織的線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察。（n=3）4.6.3丹紅注射液通過SATB1/SLC7A11/GPX4通路抑制pMCAO損傷小鼠的鐵死亡。如圖4-13所示，Model組與空白對照組相比SATB1及磷酸化的p-SATB1表達(dá)明顯下降（p<0.05，p＜0.01），DHI治療后其表達(dá)水平明顯升高（p<0.01，p＜0.05）），這表明丹紅注射液可調(diào)控pMCAO后SATB1的表達(dá)。同時，作為調(diào)節(jié)機(jī)體鐵平衡的關(guān)鍵蛋白，Model組的轉(zhuǎn)鐵蛋白TF和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TFR1的表達(dá)水平顯著上升，而在DHI治療組，它們的表達(dá)水平卻明顯降低（p<0.05）。鐵死亡的保護(hù)性因子HO-1和FTH1在pMCAO后的蛋白表達(dá)水平顯著降低（p<0.05），而在DHI治療組中，它們的蛋白水平則顯著提高。這一結(jié)果顯示，DHI可以抑制pMCAO后腦組織的鐵死亡進(jìn)程。SLC7A11和GPX4蛋白作為SATB1潛在的下游調(diào)控蛋白，它們的表達(dá)水平在Model組也有明顯的下降，DHI治療后其表達(dá)水平得到明顯的升高（p<0.05），這表明丹紅注射液有可能通過SATB1/SCL7A11/GPX4信號通路抑制pMCAO后的鐵死亡，起到保護(hù)作用。圖4-13丹紅注射液調(diào)控小鼠梗死側(cè)腦組織中相關(guān)蛋白代表性圖片及表達(dá)水平。（A）SATB1（B）SLC7A11（C）TFR1（D）GPX4（E）FTH1（F）p-SATB1（G）TF（H）HO-1。注：n=3-4，與sham組比較，#p<0.05，##p<0.01；與model組比較，*p<0.05,**p<0.01。5討論在前期的核蛋白質(zhì)組學(xué)中，我們發(fā)現(xiàn)了丹紅注射液在永久性腦缺血小鼠模型中調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SATB1的表達(dá)[17]。最近的研究也表明，SATB1缺失會影響神經(jīng)元成熟過程和神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)展[18]。但SATB1在腦缺血損傷過程中的作用仍不明確，因此我們進(jìn)一步探討丹紅注射液及SATB1對腦缺血損傷的潛在作用。永久性大腦中動脈閉塞模型（pMCAO），是腦缺血損傷的模型之一，被廣泛應(yīng)用于腦中風(fēng)機(jī)制和藥物研究。故在本章中，通過建立體內(nèi)永久性腦缺血模型，進(jìn)一步考察了SATB1在三個不同時間點(diǎn)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在6h降低最為明顯，與腦卒中治療時間窗吻合，因此選擇該時間點(diǎn)進(jìn)行研究。同時，我們利用TTC染色和神經(jīng)行為學(xué)評估了丹紅注射液對于急性腦缺血小鼠的腦梗死面積和神經(jīng)行為學(xué)評分的改善作用，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液能夠減少急性期pMCAO小鼠的腦梗死面積，提高神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。H&E染色法常用于分析組織病理損傷情況；尼氏染色法常用于觀察尼氏小體的分布和神經(jīng)細(xì)胞損傷情況。在腦缺血損傷時，腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞受到損傷，尼氏小體數(shù)量減少[19]。通過對腦病理切片的分析，我們發(fā)現(xiàn)在pMCAO模型中，丹紅注射液給藥組能夠顯著改善pMCAO小鼠的腦組織損傷，增加陽性尼氏小體的數(shù)量，證明其具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。免疫熒光技術(shù)常用于檢測目標(biāo)蛋白在特定組織和細(xì)胞類型內(nèi)的表達(dá)情況。在pMCAO模型中，丹紅注射液能夠顯著提高SATB1在NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元內(nèi)且的表達(dá)水平，提示其可能是通過調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞中SATB1的表達(dá)，在腦缺血過程中發(fā)揮潛在作用。近年來的研究指出，鐵死亡是一種鐵依賴性的非凋亡形式的細(xì)胞程序性死亡，在腦缺血治療的重要性愈發(fā)得到重視。在生物學(xué)上，鐵死亡的發(fā)生會導(dǎo)致鐵離子的代謝功能障礙，造成鐵離子含量超載，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[7]。而在形態(tài)學(xué)上，鐵死亡會導(dǎo)致線粒體形態(tài)的特征性改變，其中包括了線粒體嵴的消失或損傷，線粒體體積顯著性減小以及脂質(zhì)細(xì)胞膜的增厚，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能的障礙，造成細(xì)胞死亡ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Chen</Author><Year>2020</Year><RecNum>293</RecNum><DisplayText>[71]</DisplayText><record><rec-number>293</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="sexfdwxvkwrewuef55zv2zxe552x9029d9z0"timestamp="1675084986">293</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Chen,J.H.</author><author>Wang,Y.H.</author><author>Wu,J.Y.</author><author>Yang,J.J.</author><author>Li,M.C.</author><author>Chen,Q.X.</author></authors></contributors><titles><title>ThePotentialValueofTargetingFerroptosisinEarlyBrainInjuryAfterAcuteCNSDisease</title><secondary-title>FrontiersinMolecularNeuroscience</secondary-title></titles><periodical><full-title>FrontiersinMolecularNeuroscience</full-title><abbr-1>Front.Mol.Neurosci.</abbr-1><abbr-2>FrontMolNeurosci</abbr-2></periodical><volume>13</volume><dates><year>2020</year><pub-dates><date>Jun</date></pub-dates></dates><isbn>1662-5099</isbn><accession-num>WOS:000546841800001</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000546841800001</url></related-urls></urls><custom7>110</custom7><electronic-resource-num>10.3389/fnmol.2020.00110</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[20]。因此，我們通過普魯士藍(lán)染色、透射電鏡觀察等方法，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液可減少鐵離子蓄積，并改善pMCAO小鼠線粒體的特征性壞死，包括了線粒體膜、嵴和體積的變化，從而抑制鐵死亡。核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）被認(rèn)為是抗氧化反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，其許多下游靶基因參與了細(xì)胞中的氧化還原失衡的調(diào)節(jié)過程，而SLC7A11和GPX4作為NRF2的下游靶點(diǎn)，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)氧化和鐵死亡的進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用[21-22]。已有研究表明，在大鼠的腦缺血損傷模型中，NRF2能夠調(diào)高SLC7A11和GPX4的蛋白表達(dá)水平，抑制鐵死亡進(jìn)程，提高腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能評分，從而在發(fā)揮保護(hù)作用[23]。之前研究表明，SATB1基因的表達(dá)與氧化應(yīng)激過程密切相關(guān)[13]。因此，我們猜想在腦缺血損傷中，SATB1能夠通過調(diào)節(jié)SLC7A11和GPX4蛋白，抑制鐵死亡的進(jìn)程。于是，我們通過Westernblot分析了TfR1，TF等鐵死亡關(guān)鍵及SATB1/SLC7A11/GPX4通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在pMCAO模型中，丹紅注射液能夠激活SATB1/SLC7A11/GPX4信號通路，抑制腦缺血損傷過程中的鐵死亡進(jìn)程，發(fā)揮保護(hù)作用。參考文獻(xiàn)YuanY,ZhaiY,ChenJ,XuX,WangH.KaempferolAmelioratesOxygen-GlucoseDeprivation/Reoxygenation-InducedNeuronalFerroptosisbyActivatingNrf2/SLC7A11/GPX4Axis.Biomolecules.2021Jun22;11(7):923.doi:10.3390/biom11070923.MoorthamersS,MattarN,FrezalsL,PreseauT,GazagnesMD.ThrombolysisinanAcuteIschemicStrokePatientonDirectAnticoagulantTherapyOutsideoftheTraditionalTimeWindow:ACaseReport.Cureus.2022Sep27;14(9):e29673.doi:10.7759/cureus.29673.[3]ZengM,ZhouH,HeY,DuH,YinJ,HouY,ZhuJ,ZhangY,ShaoC,YangJ,WanH.Danhonginjectionenhancesthetherapeuticeffectofmannitolonhemisphericischemicstrokebyamelioratingblood-brainbarrierdisruption.BiomedPharmacother.2021Oct;142:112048.doi:10.1016/j.biopha.2021.112048.Epub2021Aug19.[4]JiangY,LianYJ.EffectsofDanhonginjectiononhemodynamicsandtheinflammation-relatedNF-κBsignalingpathwayinpatientswithacutecerebralinfarction.GenetMolRes.2015Dec14;14(4):16929-37.doi:10.4238/2015.December.14.21.[5]曾敏，周宏，何燕，王志，邵春，殷軍，杜宏，楊軍，萬宏。丹紅注射液通過改善缺血半暗帶細(xì)胞內(nèi)能量代謝偶聯(lián)減輕腦缺血/再灌注損傷。生物醫(yī)學(xué)藥物療法。2021年8月；140:111771.doi:10.1016/j.biopha.2021.111771.Epub2021年5月28日。[6]XuY,LiK,ZhaoY,ZhouL,LiuY,ZhaoJ.RoleofFerroptosisinStroke.CellMolNeurobiol.2023Jan;43(1):205-222.doi:10.1007/s10571-022-01196-6.[7]ZhangY,LuX,TaiB,LiW,LiT.FerroptosisandItsMultifacetedRolesinCerebralStroke.FrontCellNeurosci.2021Jun3;15:615372.doi:10.3389/fncel.2021.615372.[8]ZhuL,FengZ,ZhangJ,DuL,MengA.MicroRNA-27aRegulatesFerroptosisThroughSLC7A11toAggravateCerebralischemia-reperfusionInjury.NeurochemRes.2023May;48(5):1370-1381.doi:10.1007/s11064-022-03826-3.[9]LiuT,CuiY,DongS,KongX,XuX,WangY,WanQ,WangQ.TreadmillTrainingReducesCerebralIschemia-ReperfusionInjurybyInhibitingFerroptosisthroughActivationofSLC7A11/GPX4.OxidMedCellLongev.2022Jun6;2022:8693664.doi:10.1155/2022/8693664.

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