關(guān)于流式細胞術(shù)實驗技巧及數(shù)據(jù)分析BD公司不同型號流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto第2頁,共52頁，2024年2月25日，星期天一流式細胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動*激發(fā)光斑*熒光補償*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開窗第3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天FCM原理示意圖第4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

層流是液體穩(wěn)定流動的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細胞流動穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細胞分析分選提供技術(shù)保證.

層流技術(shù)第5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天液流驅(qū)動系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

第6頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

第8頁,共52頁，2024年2月25日，星期天激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)第9頁,共52頁，2024年2月25日，星期天.20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強度光束成形與細胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測區(qū)保證每個細胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照

FCM的單細胞照明技術(shù)第10頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共52頁，2024年2月25日，星期天熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

第12頁,共52頁，2024年2月25日，星期天UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術(shù)或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的方法稱“熒光補償”熒光補償?shù)?3頁,共52頁，2024年2月25日，星期天熒光補償?shù)?4頁,共52頁，2024年2月25日，星期天Mean值判斷補償?shù)?5頁,共52頁，2024年2月25日，星期天雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長（nm)發(fā)射波長（nm)顏色第16頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：第17頁,共52頁，2024年2月25日，星期天流式細胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞懸液制備熒光抗體標記上機檢測表型測定細胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計學(xué)分析第18頁,共52頁，2024年2月25日，星期天單分散細胞第19頁,共52頁，2024年2月25日，星期天FSCFSC信號的強弱與細胞的大小和活力相關(guān)第20頁,共52頁，2024年2月25日，星期天SSCSSC信號的強弱與細胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)第21頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞散色光信號第22頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞熒光測量細胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細胞在激發(fā)光的照射下可測到有微弱的熒光信號.細胞的特異性熒光

經(jīng)過各種特異染色的細胞在激發(fā)光的照射下可測到較強的熒光信號.第23頁,共52頁，2024年2月25日，星期天自發(fā)熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發(fā)熒光信號第24頁,共52頁，2024年2月25日，星期天特異染色的熒光信號第25頁,共52頁，2024年2月25日，星期天DNA分析比較第26頁,共52頁，2024年2月25日，星期天排除雙聯(lián)體細胞第27頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞阻滯在G2M期第28頁,共52頁，2024年2月25日，星期天雙克隆細胞周期分析第29頁,共52頁，2024年2月25日，星期天

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細胞新合成的DNA分子中，成為S期細胞的一種標記物。流式細胞術(shù)采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測細胞，不僅可檢測一個細胞群體的動力學(xué)參數(shù)和DNA含量，同時可以了解不同細胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標記染色第30頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共52頁，2024年2月25日，星期天BrdUrd與PI檢測第32頁,共52頁，2024年2月25日，星期天BrdUrd與PI檢測第33頁,共52頁，2024年2月25日，星期天BrdUrd與PI檢測第34頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞三色熒光檢測第35頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞因子測定*檢測T細胞(CD69)活化第36頁,共52頁，2024年2月25日，星期天G6=R1*R5第37頁,共52頁，2024年2月25日，星期天*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強度下調(diào)第38頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞因子分析圖*過敏性鼻息肉與鼻息肉細胞因子比較第39頁,共52頁，2024年2月25日，星期天純化單核細胞第40頁,共52頁，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)性T細胞檢測第41頁,共52頁，2024年2月25日，星期天第42頁,共52頁，2024年2月25日，星期天G3=R1*R3G4=R1*R4第43頁,共52頁，2024年2月25日，星期天凋亡細胞測定第44頁,共52頁，2024年2月25日，星期天凋亡細胞測定第45頁,共52頁，2024年2月25日，星期天細胞凋亡檢測第46頁,共52頁，2024年2月25日，星期天陰性的設(shè)置第47頁,共52頁，2024年2月25日，星期天