關(guān)于實(shí)驗(yàn)四基因組的提取和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.了解真核生物基因組DNA提取的一般原理。2.了解基因組DNA的實(shí)驗(yàn)用途。3.掌握基因組DNA提取的方法和步驟。第2頁,共14頁，2024年2月25日，星期天材料：花椰菜/昆蟲組織設(shè)備：移液器，高速離心機(jī)，水浴鍋，培養(yǎng)箱

。試劑：1.CTAB組織消化液2.氯仿3.無水乙醇4.TE緩沖液第3頁,共14頁，2024年2月25日，星期天CTAB溶液配制2%CTAB溶液：100mmol/LTris-HCl,pH7.0；1.4mol/LNaCl；20mmol/LEDTA；2%CTAB.

10mlfinalconc.（終濃度）CTAB0.2g2%H2O5.78ml

1MTris-HCl1.0ml100mM5MNaCl2.8ml1.4M0.5MEDTA0.4ml20mM第4頁,共14頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)原理（CTAB法）CTAB，十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可使細(xì)胞破裂，釋放出核酸；CTAB溶液中含有1.4mol/LNaCl，有助于溶解釋放出來的DNA（DNA在2mol/LNaCl中DNA具有較高的溶解度）；加入無水乙醇，可以使DNA從溶液中沉淀出來。第5頁,共14頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)步驟（常溫操作，2人一組）取適量(300-500mg)植物組織，加入2mlCTAB抽提緩沖液，充分勻漿2-3min，然后每人轉(zhuǎn)移700ul的勻漿液至一支1.5ml離心管中，65℃水浴45min（中間搖動(dòng)2-3次）（裂解細(xì)胞，釋放核酸和蛋白）；加入700ul的氯仿，上下?lián)u動(dòng)2-3min(此步是萃取組織液中的蛋白質(zhì)；務(wù)必帶上手套！）；12000rpm離心10min，取400ul上清液轉(zhuǎn)移至一支1.5ml離心管中（由于此時(shí)懸液已經(jīng)分層，而我們需要取最上層的溶液，所以注意千萬不要使槍頭觸碰到中間的雜質(zhì)層，當(dāng)然，更不能取吸取下層的萃取液了）；加入1/10體積的NaAc(3mol/L,pH5.2）（40ul），上下顛倒3-4次混勻；然后再加入2倍體積的無水乙醇（0.9ml)，上下顛倒3-4次混勻（如DNA量大，此時(shí)可見絮狀DNA沉淀。（如果放置于-20度過夜，DNA產(chǎn)率會(huì)更多?。┑?頁,共14頁，2024年2月25日，星期天12000rpm離心5min，緩緩倒掉上清液（剩余的液體可以用移液器吸走），管底的沉淀即DNA（無色透明膠狀物?。?；加入200ulTE緩沖液（含50ug/mlRNase），輕彈管底，以溶解DNA；也可以用槍頭緩慢地來回吸放液體來幫助溶解DNA。此時(shí)應(yīng)該可以看到片狀的DNA沉淀物逐漸變少，最終消失。（一定要使DNA完全溶解于TE中，否則影響電泳效果?。?；將DNA溶液置于37℃培養(yǎng)箱或水浴中30min（降解殘留的RNA）；-20℃保存?zhèn)溆?。?~10ulDNA（加適量loadingbuffer）電泳檢測(cè)；取2ulDNA測(cè)定濃度和OD260/280（下次課電泳檢測(cè)）。第7頁,共14頁，2024年2月25日，星期天基因組DNA的檢驗(yàn)（純度）紫外分光光度法：核酸在260nm處有最大吸收峰蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰1.7<OD260/OD280<1.9OD260/OD230>2.0第8頁,共14頁，2024年2月25日，星期天基因組DNA的檢驗(yàn)（完整性）凝膠電泳法：基因組DNA電泳，在電場(chǎng)中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象。

第9頁,共14頁，2024年2月25日，星期天M123456M123456123456材料質(zhì)量（mg）100300500100300500所加TE體積（ul）200200200400400400260/2802.031.971.922.072.022.01260/2302.102.312.192.051.952.02濃度（ng/ul）254.5454.4569.5139.6262.1320.0上樣2ul上樣8ul注：1-6序號(hào)分別與表中對(duì)應(yīng)。第10頁,共14頁，2024年2月25日，星期天核酸的貯存——DNA保存1）短期貯存：4℃或-20℃存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中。

TE緩沖液(PH為8.0)，可減少DNA脫氨反應(yīng)；EDTA可以抑制DNase的活性。2）長期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；第11頁,共14頁，2024年2月25日，星期天無水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等鹽離子，作用是中和核酸分子表面的負(fù)電荷，減少分子間的排斥力，有助于分子之間的聚集。無水乙醇可以吸收分子之間的水，使DNA沉淀析出，第12頁,共14頁，2024年2月25日，星期天基因組DNA提