--青霉素類抗生素微生物發(fā)酵發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第1頁青霉素介紹

化學(xué)結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)

青霉素合成及調(diào)控生物合成

生物合成調(diào)控青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝

菌種發(fā)酵工藝流程培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)控制

發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第2頁青霉素介紹發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第3頁青霉素發(fā)覺

1929年英國學(xué)者弗萊明首先在抗生素中發(fā)覺了青霉素，英國謝菲爾德大學(xué)病理學(xué)家弗洛里實(shí)現(xiàn)對(duì)青霉素分離與純化。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第4頁青霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)青霉素是含有青霉素母核各種化合物總稱，青霉素發(fā)酵液中最少含有5種以上不一樣青霉素：青霉素F、青霉素X、青霉素K及二氫青霉素F等。青霉素分子結(jié)構(gòu)球棍模型發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第5頁青霉素合成及調(diào)控發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第6頁青霉素生物合成發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第7頁青霉素生物合成與賴氨酸反饋調(diào)整用產(chǎn)黃霉菌生產(chǎn)青霉素要受到賴氨酸阻遏，這是因?yàn)槠滟嚢彼嵘锖铣陕窂匠跏济浮邫幟仕岷铣擅甘艿搅速嚢彼岱答佔(zhàn)瓒?。在賴氨酸生物合成路徑中，從氨基己二酸分支而產(chǎn)生青霉素，這種賴氨酸阻遏是初級(jí)代謝調(diào)整效果用到次級(jí)代謝上最好例子。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第8頁青霉素生物合成與糖分解代謝關(guān)系青霉素生物合成受糖分解代謝產(chǎn)物阻遏，如合成青霉素?；D(zhuǎn)移酶就會(huì)被阻遏。在青霉素發(fā)酵過程中，發(fā)覺能被青霉素快速利用葡萄糖有利于菌體生長(zhǎng)，但抑制青霉素合成，而被遲緩利用乳糖，卻是生產(chǎn)青霉素最好碳源。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第9頁

乳糖比葡萄糖優(yōu)越主要原因是乳糖被水解成單糖速度恰好符合青霉素生產(chǎn)期合成青霉素需要，而又不會(huì)產(chǎn)生高濃度分解產(chǎn)物來抑制青霉素合成，所以，碳源多用葡萄糖加乳糖或利用一些非糖原料如植物油等。但因?yàn)槿樘莾r(jià)格較貴，成本較高，故在生產(chǎn)實(shí)踐中常經(jīng)過間隙或滴加葡萄糖方法控制培養(yǎng)液中糖含量，以符合菌體生長(zhǎng)和青霉素生物合成需要。這么，能夠降低成本，提升產(chǎn)量。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第10頁青霉素生產(chǎn)發(fā)酵工藝發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第11頁菌種當(dāng)前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，依據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，慣用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第12頁青霉素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)過程分生孢子發(fā)芽期菌絲繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒降低，小空孢大空孢自溶菌絲生長(zhǎng)久青霉素分泌期菌絲自溶期發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第13頁培養(yǎng)基碳源青霉菌能利用各種碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。當(dāng)前采取淀粉水解糖，糖化液進(jìn)行流加。氮源可采取玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機(jī)氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機(jī)氮源。前體為生物合成含有芐基基團(tuán)青霉素G，需要在發(fā)酵中加入前體如苯乙酸或苯乙酰胺。因?yàn)樗鼈儗?duì)青霉素有一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采取屢次加入方式。無機(jī)鹽包含硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。鐵離子對(duì)青霉素有毒害作用，應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵液中鐵含量在30ug/mL以下。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第14頁青霉素生產(chǎn)工藝過程

發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第15頁抗生素制備普通流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗(yàn)成品包裝前體發(fā)酵階段提取階段發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第16頁發(fā)酵工藝流程發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第17頁一、總述青霉素發(fā)酵——將青霉菌接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間，得到青霉菌孢子培養(yǎng)物。用無菌水將孢子制成懸浮液接種到種子罐內(nèi)已滅菌培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。然后將種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵罐已滅菌含有苯乙酸前體培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，培養(yǎng)。

青霉素菌種發(fā)酵工藝原理發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第18頁發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第19頁二、青霉素發(fā)酵過程青霉素發(fā)酵時(shí)，青霉素生產(chǎn)菌在適當(dāng)培養(yǎng)基、PH、溫度和通氣攪拌等發(fā)酵條件下進(jìn)行生長(zhǎng)并合成青霉素。發(fā)酵開始前，相關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基（主要是碳源、氮源、前體和無機(jī)鹽等）必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。在整個(gè)過程中，需要不停通氣和攪拌，維持一定罐溫和罐壓，在發(fā)酵過程中往往要加入泡沫劑，假如酸堿控制發(fā)酵液PH，還需要間歇或連續(xù)加入葡萄糖及銨鹽等化合物以補(bǔ)充碳源及氮源，或補(bǔ)進(jìn)其它料液和前體等以促進(jìn)青霉素生產(chǎn)。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第20頁青霉素發(fā)酵過程中代謝改變分為菌體生長(zhǎng)、青霉素合成和菌體自溶三個(gè)階段。菌體生長(zhǎng)階段：發(fā)酵培養(yǎng)基接種后生產(chǎn)菌在適當(dāng)環(huán)境中經(jīng)過短時(shí)間適應(yīng)，即開始發(fā)育、生長(zhǎng)和繁殖，直至到達(dá)菌體臨界濃度。青霉素合成階段：這個(gè)階段主要合成青霉素，青霉素生產(chǎn)速率到達(dá)最大，并一直維持到青霉素合成能力衰退。在這個(gè)階段，菌體重量有所增加，但產(chǎn)生菌呼吸強(qiáng)度普通無顯著改變。菌體自溶階段：這個(gè)階段菌體衰老，細(xì)胞開始自溶，合成青霉素能力衰退，青霉素生產(chǎn)速率下降，氨基氮增加，PH上升。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第21頁發(fā)酵培養(yǎng)控制加糖控制。殘?zhí)墙抵?.6%，pH上升時(shí)加糖補(bǔ)氮及加前體。補(bǔ)氮：硫酸銨、氨、尿素，使發(fā)酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前體：發(fā)酵液中殘余乙酰胺濃度為0.05%~0.08%。pH控制。6.6~6.4溫度。前期25℃

~26℃

，后期23℃

。溶解氧。不低于飽和溶解氧30%。泡沫控制。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第22頁

基質(zhì)濃度：在分批發(fā)酵中，經(jīng)常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過高，后期基質(zhì)濃度低，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制。為了防止這一現(xiàn)象,在青霉素發(fā)酵中通常采取補(bǔ)料分批操作法,即對(duì)輕易產(chǎn)生抑制和限制作用基質(zhì)維持一定最適濃度。溫度：青霉素發(fā)酵最適溫度普通認(rèn)為應(yīng)在25°C左右。溫度過高將顯著降低發(fā)酵產(chǎn)率,同時(shí)增加葡萄糖維持消耗,降低葡萄糖至青霉素轉(zhuǎn)化率。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第23頁pH值：青霉素發(fā)酵最適pH值普通認(rèn)為在6.5左右,應(yīng)盡可能防止pH值超出7.0。因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定,輕易加速其水解。溶氧:對(duì)于好氧青霉素發(fā)酵來說,溶氧濃度是影響發(fā)酵過程一個(gè)主要原因。當(dāng)溶氧濃度降到30%飽和度以下時(shí),青霉素產(chǎn)率急劇下降,低于10%飽和度時(shí),則造成不可逆損害。溶氧濃度過高,說明菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過低,造成呼吸強(qiáng)度下降,一樣影響生產(chǎn)能力發(fā)揮。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第24頁

菌絲濃度：發(fā)酵過程中必須控制菌絲濃度不超出臨界菌體濃度,從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在某一溶氧水平上到達(dá)平衡。菌絲生長(zhǎng)速度：在葡萄糖限制生長(zhǎng)條件下，當(dāng)比生長(zhǎng)速率低于0.015h-1時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率成正比。所以,要在發(fā)酵過程中到達(dá)并維持最大比生產(chǎn)速率,必須使比生長(zhǎng)速率不低0.015h-1。菌絲形態(tài)：青霉素產(chǎn)生菌分化主要呈絲狀生長(zhǎng)和結(jié)球生長(zhǎng)兩種形態(tài)。在絲狀菌發(fā)酵中,控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)分支和長(zhǎng)度,并防止結(jié)球,是取得高產(chǎn)關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中,使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊,并盡可能降低游離菌絲含量,也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力關(guān)鍵素之一。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第25頁

碳酸鈣：用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生雜酸，并控制發(fā)酵液pH值。苯乙酸/苯乙酰胺：能夠借?；D(zhuǎn)移作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提升青霉素生產(chǎn)強(qiáng)度。P和S：為菌體提供營(yíng)養(yǎng)無機(jī)磷源普通采取磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需硫。發(fā)酵工程青霉素的制備專家講座第26頁

另外，因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中二氧化碳不停產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源含有蛋白質(zhì)，所以在發(fā)酵罐內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵液逃液