2024/4/29第五章

色譜分析法5.4.1高效液相色譜法的特性5.4.2流程及主要部件5.4.3主要分離類型與操作條件選擇5.4.4高效液相色譜法的應用第四節(jié)

高效液相色譜法2024/4/295.4.1

高效液相色譜法的特性

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。2024/4/295.4.2流程及主要部件液相色譜儀2024/4/29液相色譜儀（2）2024/4/29液相色譜儀（3）2024/4/29液相色譜儀（4）2024/4/29液相色譜儀（5）2024/4/29液相色譜儀（6）2024/4/29流程及主要部件2024/4/292.主要部件(1)高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。應具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。2024/4/29(2)梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2024/4/29(3)進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結構如圖所示：2024/4/29(4)高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2024/4/29(5)高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器（UV）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。2024/4/29光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2024/4/295.4.3

主要分離類型與操作條件的選擇

1.主要分離類型（1）吸附色譜（液-固吸附色譜）以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。（2）分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相，即用化學反應的方法通過化學鍵將固定液結合在擔體表面。2024/4/29（3）離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機酸或無機堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團的交換能力的不同而得到分離。（4）凝膠色譜（空間排阻色譜）以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結構和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質凝膠。2024/4/29高效液相色譜分離類型選擇示意圖

2024/4/292.

影響分離的因素及操作條件選擇在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，而只有兩項，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：影響分離的主要因素有流動相的流量、性質和極性。2024/4/29（1）影響分離的因素——流速流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。2024/4/292.固定相及分離柱

氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領域。2024/4/293.流動相及流動相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。

2024/4/29流動相組成

流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2024/4/29選擇流動相時應注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應有紫外吸收。2024/4/295.4.4

高效液相色譜法的應用1.水不溶性物質的分析

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC

柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2024/4/292.水溶性物質的分析如有機酸堿化合物：離子交換樹脂為固定相，無機酸堿的水溶液為流動相，采用離子交換的分離方式進行分析。對于溶于水，不離解的試樣，可采用反相液液分配色譜的分離方式。

2024/4/293.手性化合物分離手性化合物分離：采用手性固定相。目前應用較多的高效液相色譜手性固定相有手性冠醚和環(huán)糊精。

2024/4/294.液相制備色譜高效液相色譜法還可利用其高效分離的特點，將柱后流出的組分分別收集，蒸去流動相后獲得難以通過一般方法制備的高純度樣品（色譜