植物蛋白的提取方法一、單層貼壁細胞總蛋白的提取1.倒掉培養(yǎng)液,并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液(或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走)。2.每瓶細胞加3ml4℃預冷的PBS(0.01MpH=7.2～7.3)。平放輕輕搖動1min洗滌細胞,然后棄去洗液。重復以上操作兩次,共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3.按1ml裂解液加10μlPMSF(100mM),搖勻置于冰上(PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合)。4.每瓶細胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,為使細胞充分裂解,培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖動。5.裂解完后,用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)(動作要快),然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中(整個操作盡量在冰上進行)。6.于4℃下12000rpm離心5min(提前開離心機預冷)。7.將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5ml的離心管中放于-20℃保存。二、組織中總蛋白的提取1.將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位,用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2.加400μl單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中,進行勻漿。然后置于冰上。3.幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上,要重復碾幾次使組織盡量碾碎。4.裂解30min后,即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中,然后在4℃下12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。三、加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取由于受藥物的影響,一些細胞脫落下來,所以除按方法一操作外還應收集培養(yǎng)液中的細胞。以下是培養(yǎng)液中細胞總蛋白的提取:1.將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中,于2500rpm離心5min。2.棄上清,加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌,然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。3.用槍吸干上清后,加100μl裂解液(含PMSF)冰上裂解30min,裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細胞充分裂解。4.將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中并置于-20℃保存。四、LoadingBuffer煮細胞抽提總蛋白1.細胞計數(shù)(約1×106的細胞),離心收集細胞(2000rpm×5min);2.預冷1×PBS500ul重懸洗一次,轉(zhuǎn)至500ulEP管(2000rpm×5min);3.去上清,后甩一次,將上清去盡;4.按每1×106的細胞加50ul

loadingbuffer

加入2×loading;5.Vortex一下,煮10～15min一次×2～3次直至無粘絲;6.每次煮好將其放于冰上,靜置約2min,Vortex一下,再甩一下;7.三次后用槍吸起,如沒有粘絲,即可;8.每次上樣約5ul(50ug/ul蛋白)。五、RIPA裂解抽提總蛋白1.細胞計數(shù)(約1×107的細胞),離心收集細胞(2000rpm×5min);2.預冷1×PBS1ml重懸洗2次,轉(zhuǎn)至1.5mlEP管(2000rpm×5min);3.去上清,后甩一次,將上清去盡;4.按照如下比例加入裂解試劑:RIPA:300ul/1×107細胞PMSF:3ul(1:100)Cocktail:0.3ul(1:1000)5.吹打均勻,冰上放置30-40min,中間每10分鐘Vortex一次;6.4℃預冷離心:10000rpm×10min;7.收集上清,轉(zhuǎn)移至已預冷新EP管,即為總蛋白。六、核、漿蛋白抽提收漿蛋白1.細胞計數(shù)(約1.5×107的細胞),離心收集細胞(1100rpm×5min);2.用4℃預冷的PBS重懸,轉(zhuǎn)至1.5mL的EP管中,離心(4000rpm×5min,4℃);3.去上清,加入A

Buffer

1mL/1×107

cell,重懸,4℃放置10min,離心(2500rpm×3min,4℃);4.去上清,加入A’

Buffer

250uL/1.5×107

cell,重懸,4℃放置3min,離心(5000rpm×1min,4℃),吸取上清(上清是漿蛋白);收核蛋白5.再用A’

Buffer

500uL/1.5×107cell,重懸,4℃放置3min,離心(5000rpm×1min,4℃),吸走上清,12000rpm×30sec,把上清完全吸干凈;6.剩余沉淀中加入B’

Buffer

(或者RAPI)50uL,重懸(振蕩),4℃放置40min(每隔10min振蕩一次);7.離心(12000×10min,4℃),取上清即為核蛋白,-80℃保存。BufferA的配制:剩余體積用ddH2O補足至要求體積!BufferA’的配制:BufferA’(2ml)

=1960ulBufferA+40uL10%NP-40

+20uL10mg/mLPMSF+1uLAprotininBufferA’(1ml)

=

980ulBufferA+20uL10%NP-40+10uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin(Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的時候可以不加)BufferB

的配制:剩余體積用ddH2O補足至要求體積!BufferB’的配制:BufferB’

=1mLBufferB+10uL10mg/mLPMSF+0.5uLAprotinin(可以用cockltail代替)七、核基質(zhì)蛋白抽提Protocol1、細胞計數(shù)(約1×107的細胞),離心(1100rpm×5min)收集細胞;2、用4℃預冷的PBS重懸,將細胞移至1.5mlEP管中,1×PBS洗一遍;3、加300ul

RIPA/1×107的細胞,裂解細胞,至冰上15-30min;RIPA+PMSF(1:100)+Cocktail(1:1000)4、4℃預冷離心:13000rpm×10-15min;5、將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已4℃預冷的1.5mlEP管,冰上備用(總蛋白);6、用1×PBS洗管底的pellet×2遍;7、加入Urea-Lysisbuffer

10-15ul裂解pellets,vortex10min;8、4℃預冷離心:13000rpm×10min;用BufferA90ul稀釋,此為核基質(zhì)蛋白。RIPA(PH8.0):150mMNaCL1%NP-400.5%DOC0.1%SDS50mMTrisUrea-Lysisbuffer(PH8.0):100mMNaH2PO410mMTris-HCL300mMNaCL8MureaBufferA:100mMNaH2PO410mMTris-HCL300mMNaCL1%TritonX-100八、植物組織蛋白質(zhì)提取方法1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據(jù)材料不同適當加入),準備提取液放在冰上。2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中,在冰上靜置(3-4小時)。3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃。4、提取上清液,樣品制備完成。蛋白質(zhì)提取液:300ml1、1Mtris-HCl(PH8)45ml2、甘油(Glycerol)75ml3、Polyvinylpolypyrrordone6g這種方法針對SDS,垂直板電泳!或者用C2HCl3O2—C3H6O沉淀法,這種方法針對雙向電泳,具有雜質(zhì)少、離子濃度小的特點。當然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少!1、在液氮中研磨葉片。2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1小時)棄上清。3、加入等體積的冰浴C3H6O(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時),然后真空干燥沉淀,備用。4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準),可臨時保存在4℃待用。5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆?。藥?提取液:含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的C3H6O裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml九、組織中提取蛋白，腸黏膜為例應用TRIPURE

提取蛋白質(zhì)步驟:1、含蛋白質(zhì)上清液中加入C3H8O:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)倒轉(zhuǎn)混勻,置室溫10min離心:12000g,10min,4度,棄上清2、加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)振蕩,置室溫20min離心:7500g,5min,4度,棄上清重復0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次3、沉淀中加入100%乙醇2ml充分振蕩混勻,置室溫20min離心:7500g,5min,4度,棄上清,吹干沉淀4、1%SDS溶解沉淀離心:10000g,10min,4度5、取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)存在的問題:加入1%SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉淀,SDS結(jié)晶?測濃度,含量才1mg/ml左右。解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2XBUFFER,然后煮5-10分鐘,效果很好的。十、腫瘤組織0-4°C生理鹽水沖洗組織表面血跡,以1:9(即100ug重量加入900ul體積)的比例加入蛋白勻漿提取液,0-4°C冰水混合物中用1ml勻漿器制成10%的蛋白勻漿。勻漿在10000xg離心10-15分鐘,取上清備用。蛋白勻漿提取液(PH7.6):Nacl50mM

Tris10mM

EDTA1mM,

PMSF1mM,Na3VO4.12H2O0.5mM

NaF50mM

Benzamidine1mM十一、腦組織將切取的組織用4℃預冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血漬,再用濾紙吸干殘留的PBS,將組織稱重,將0.1g組織放入1ml的玻璃勻漿器,加入800l裂解液在冰上充分勻漿,將得到的勻漿液用液氮反復凍融3次,室溫靜置30mins,4℃15000r/min離心1h,小心避開脂層,吸取上清,分裝,-80℃保存。裂解液配方如下:尿素7mol/lCH4N2S

2mol/lCHAPS4%(m/v)DTT65Mmol/L(上樣前臨加)IPGBuffer0.5%(V/V)(上樣前臨加)PMSF2ug/l(m/V)(上樣前臨加)DNA酶12ug/l(m/V)(上樣前臨加)RNA酶A2ug/l(m/V)(上樣前臨加)十二、酵母蛋白的提取方法1.準備SD/-Leu或是YPD培養(yǎng)基20ml,酵母過夜培養(yǎng),30℃,230rpm。2.測OD600

約1.0。3.100ml過夜培養(yǎng)物,1000g,離心,5min,4℃。4.棄上清,重懸于80ul抽提buffer:0.1MTris-Cl(PH7.5),0.2MNaCl,0.01Mβ-ME,20%甘油,5mMEDTA,1mMPMSF。(100×):PMSF0.1742g溶于10mlC5H12O(主要抑制絲氨酸蛋白激酶),RT保存。5.轉(zhuǎn)移上清到一預冷的玻璃管中,再加入玻璃珠33ul(425-600um)。冰上操作,渦流10min,但不包括樣品的預冷時間。6.回收玻璃珠,并盡可能取上清到另一預冷的玻璃管中。7.40ul的抽提buffer,同上渦流。8.離心后分離上清(回收玻璃珠)。9.液氮快速冷凍,-70℃儲存。十三、細菌總蛋白和膜蛋白提取方法（1）從新鮮樣品中提取總蛋白（簡易法）1、自配裂解液（pH8.5-9.0）：50mMTris-HCl，2mMEDTA,100mMNaCl，0.5%TritonX-100，調(diào)pH值至8.5-9.0備用；用前加入100μg/ml溶菌酶，1μl/ml的蛋白酶抑制劑PMSF。該裂解液用量為10-50ml裂解液/1g濕菌體。2、將40ml菌液在12000g，4℃下離心15分鐘收集菌體，沉淀用PBS懸浮洗滌2遍，沉淀加入1ml裂解液懸浮菌體。3、超聲粉碎，采用300w，10s超聲/10s間隔，超聲20min，反復凍融超聲3次至菌液變清或者變色。4、1000g離心去掉大碎片，上清可直接變性后PAGE電泳檢測，或者用1%SDS溶液透析后凍存。缺點：Westernblotting結(jié)果表明，疏水性跨膜蛋白提取效率有限。（2）從Trizol裂解液中分離總蛋白1、Trizol溶解的樣品研磨破碎后，加氯仿分層，2-8℃下10000g離心15min，上層水相用于RNA提取，體積約為總體積的60%。2、用乙醇沉淀中間層和有機相中的DNA。每使用1mlTrizol加入0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3min，2-8℃不超過2000g離心5min。3、將上清移至新的EP管中，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1mlTrizol加入1.5ml異丙醇，室溫放置10min，2-8℃下12000g離心10min，棄上清。4、用含有0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌。每1mlTrizol加入2ml洗液，室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清，重復洗滌2次。最后加入2ml無水乙醇，渦旋后室溫放置20min，2-8℃下7500g離心5min，棄上清。5、冷凍干燥5-10min，1%