Chapter3

TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1/62酶生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成法(Biosynthesis)化學(xué)合成法(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample酶生產(chǎn)：指經(jīng)過各種方法取得人們所需酶技術(shù)過程2/62一、提取分離法酶提?。涸谝欢l件下，用適當(dāng)溶劑處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑中過程。主要提取方法：鹽溶液提取酸溶液提取堿溶液提取有機溶劑提取等注意選擇適當(dāng)溶劑！??！3/62優(yōu)點：提取方法簡單方便缺點：必須先取得含酶組織或細胞受氣候環(huán)境影響若培養(yǎng)細胞則工藝路線變復(fù)雜產(chǎn)品含雜質(zhì)較多，分離純化較困難4/62適用范圍在動植物資源豐富地域從動物胰臟中提取各種胰蛋白酶，小腸中提取堿性磷酸酶5/62二、生物合成法（發(fā)酵法）利用微生物細胞、植物細胞或動物細胞生命活動而取得人們所需酶技術(shù)。6/62細胞培養(yǎng)方式不一樣液體深層培養(yǎng)發(fā)酵固體培養(yǎng)發(fā)酵固定化細胞發(fā)酵固定化原生質(zhì)體發(fā)酵酶發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，經(jīng)過人工操作，利用微生物生命活動取得所需酶技術(shù)過程。7/621、固體培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，加入其它必要營養(yǎng)成份，制成固體或半固體曲麩，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶微生物菌株，在一定條件下進行發(fā)酵，以取得所需酶。8/62優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便。麩曲中酶濃度尤其高，尤其適合用于各種霉菌培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物。缺點：勞動強度大，原料利用率低，生產(chǎn)周期長。9/622、液體深層發(fā)酵將液體培養(yǎng)基置于生物反應(yīng)器中，經(jīng)過滅菌、冷卻后，接種產(chǎn)酶細胞，在一定條件下進行發(fā)酵，生產(chǎn)得到所需酶。優(yōu)點：機械化程度較高，技術(shù)管理較嚴(yán)格，酶產(chǎn)率較高，質(zhì)量較穩(wěn)定，產(chǎn)品回收率較高。是當(dāng)前酶發(fā)酵生產(chǎn)主要方式。10/62優(yōu)點：生產(chǎn)周期短酶產(chǎn)率較高不受資源限制缺點：對發(fā)酵設(shè)備和工藝條件要求較高11/62三、化學(xué)合成法是一個新興技術(shù)不足單體底物要求純度高成本高昂只能合成已經(jīng)清楚化學(xué)結(jié)構(gòu)酶12/62化學(xué)合成法新進展模擬酶13/62第一節(jié)酶生物合成過程及調(diào)整14/62Reversetranscription1、中心法則-CentralDogma15/62Replication復(fù)制：親代DNA或RNA在一系列酶作用下，生成與親代相同子代DNA或RNA過程。Transcription轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對標(biāo)準(zhǔn)將其所含遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補RNA過程。Translation翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA密碼解讀成蛋白質(zhì)AA次序過程。Reversetranslation逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，生成DNA過程。16/622、RNA生物合成(轉(zhuǎn)錄)-Transcription細胞內(nèi)RNA生物功效(1)在一些RNA病毒中，其所含雙鏈RNA作為遺傳信息載體。

(2)在蛋白質(zhì)生物合成過程中，各種RNA起著主要作用。tRNA作為氨基酸載體，并由其上反密碼子識別mRNA分子上密碼子；mRNA作為蛋白質(zhì)合成模板，由其分子上三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸排列次序；rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體（核糖體），作為蛋白質(zhì)生物合成場所。(3)一些RNA含有生物催化活性，屬于核酸類酶，在一定條件下，能夠催化相關(guān)生化反應(yīng)。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)整等方面有主要作用。17/62轉(zhuǎn)錄過程特點1、轉(zhuǎn)錄不對稱性反義鏈antisensestrand（無意義鏈，負鏈）有義鏈codingstrand（編碼鏈，正鏈）2、轉(zhuǎn)錄所需酶18/62轉(zhuǎn)錄過程起始位點識別recognition轉(zhuǎn)錄起始initiation鏈延伸elongation轉(zhuǎn)錄終止termination轉(zhuǎn)錄后加工modification19/62TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’

s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)20/62轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵酶與σ因子結(jié)合成全酶全酶與DNA模板結(jié)合生成不穩(wěn)定復(fù)合物，沿模板移動尋找到開啟子生成酶與開啟子復(fù)合物DNA雙螺旋部分解鏈σ因子釋放21/62轉(zhuǎn)錄延伸22/62RNA鏈合成終止RNA聚合酶抵達終止密碼子，RNA與酶從DNA上脫離，RNA鏈合成終止RNA前體加工剪切反應(yīng)剪接反應(yīng)末端連接反應(yīng)核苷修飾反應(yīng)23/6224/623、蛋白質(zhì)合成(翻譯)-Translation翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸次序所組成密碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成過程.mRNA蛋白質(zhì)翻譯

各種信息各種蛋白質(zhì)（核苷酸排列次序）（氨基酸排列次序）25/62蛋白質(zhì)合成幾個要素-mRNA(模板，template)mRNA是帶有DNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成直接模板。以mRNA為模板,合成一定結(jié)構(gòu)多肽鏈過程(翻譯)，就是將mRNA分子中核苷酸排列次序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中氨基酸排列次序。26/62蛋白質(zhì)合成幾個要素-遺傳密碼，nucleotidetripletcodonmRNA分子中,每三個相鄰核苷酸組成三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息，稱為密碼子或三聯(lián)密碼。四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子。其中：一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數(shù)氨基酸擁有2-4個密碼27/6228/6229/62蛋白質(zhì)合成幾個要素-轉(zhuǎn)運RNA(transporter)tRNA是氨基酸轉(zhuǎn)運工具，攜帶活化氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性，最少有20種以上。每種tRNA反密碼環(huán)頂端都有由三個核苷酸組成反密碼，能與mRNA上對應(yīng)密碼互補結(jié)合。30/62酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)堿基配對31/62蛋白質(zhì)合成幾個要素-核糖體，ribosome核糖體（或稱核糖核蛋白體）由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細胞質(zhì)內(nèi)微小顆粒。32/62Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell33/62蛋白質(zhì)合成幾個要素-其它因子和酶其它輔助因子工具酶34/62蛋白質(zhì)合成過程肽鏈合成起始initiation肽鏈合成延伸elongation肽鏈合成終止與釋放terminationandrelease合成多肽輸送和加工transportandmodification蛋白質(zhì)分子折疊folding35/62氨基酸活化生成氨酰-tRNA反應(yīng)式A.A+tRNA+ATP氨酰tRNA合成酶氨酰-tRNA+AMP+PPi普通而言，原核生物第一個氨基酸是甲酰甲硫氨酸，起始tRNA是fMet-tRNAF。真核生物第一個氨基酸是甲硫氨酸，起始tRNA是Met-tRNAMET。36/62蛋白質(zhì)合成起始30S亞基+IF3

mRNA30S-IF3-mRNA復(fù)合物fMet-tRNAF+IF2+GTPfMet-tRNAF-IF2-GTPIF130S起始復(fù)合物70S核糖體IF1、IF2、IF3GDP+Pi37/6238/62進位轉(zhuǎn)位成肽肽鏈延伸39/62合成終止40/62高效率蛋白質(zhì)合成體系41/6242/624、酶生物合成調(diào)整(regulation)43/62組成酶：DNA酶，RNA酶，糖酵解路徑酶（與生長發(fā)育條件無關(guān)，常進行定量合成酶）調(diào)整酶：適應(yīng)酶，β-半乳糖苷酶（誘導(dǎo)酶）酶類型44/62ABEX底物水平調(diào)整酶水平調(diào)整

酶活性調(diào)整酶含量調(diào)整酶定位調(diào)整輔助因子調(diào)整生長發(fā)育不一樣時期外界環(huán)境改變酶合成與分解速度改變（基因表示調(diào)控）產(chǎn)物調(diào)整細胞內(nèi)酶調(diào)控模式45/621960年Jacob和Monod提出操縱子學(xué)說調(diào)整基因(R)：產(chǎn)生阻遏蛋白開啟基因(P)操縱基因(O)：與阻遏蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)基因(S)：蛋白多肽鏈產(chǎn)物操縱子1.RNA聚合酶結(jié)合位點2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-CRP）結(jié)合位點（1）操縱子學(xué)說46/62操縱子學(xué)說莫諾與雅可布最初發(fā)覺是大腸桿菌乳糖操縱子。這是一個十分巧妙自動控制系統(tǒng)，這個自動控制系統(tǒng)負責(zé)調(diào)控大腸桿菌乳糖代謝。

乳糖可作為培養(yǎng)大腸桿菌能源。大腸桿菌能產(chǎn)生一個酶（叫做“半乳糖苷酶”），能夠催化乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，方便作深入代謝利用。編碼半乳糖苷酶基因（簡稱z）是一個結(jié)構(gòu)基因。這個結(jié)構(gòu)基因與操縱基因共同組成操縱子。操縱基因受一個叫作阻遏蛋白蛋白質(zhì)調(diào)控。當(dāng)阻遏蛋白結(jié)合到操縱基因之上時，乳糖會起誘導(dǎo)作用，它與阻遏蛋白結(jié)合，使之從操縱基因上脫落下來。這時，操縱基因開啟，相鄰結(jié)構(gòu)基因也表現(xiàn)活性，細菌就能分解并利用乳糖了，這么，乳糖便成了誘導(dǎo)半乳糖苷酶產(chǎn)生誘導(dǎo)物。

60年代中期，在操縱子中還發(fā)覺了另一個開關(guān)基因，稱為開啟基因。開啟基因位于操縱基因之前，二者緊密相鄰。開啟基因由環(huán)腺苷酸（cAMP）開啟，而環(huán)腺苷酸能被葡萄糖所抑制。這么，葡萄糖便經(jīng)過抑制環(huán)腺苷酸而間接抑制開啟基因，使結(jié)構(gòu)基因失活，停頓合成半乳糖苷酶。

由此可知，結(jié)構(gòu)基因同時受兩個開關(guān)基因——操縱基因與開啟基因調(diào)控。只有當(dāng)這兩個開關(guān)都處于開啟狀態(tài)時，結(jié)構(gòu)基因才能活化。當(dāng)培養(yǎng)基中同時存在葡萄糖和乳糖時，葡萄糖經(jīng)過抑制環(huán)腺苷酸而間接抑制開啟基因，并進而抑制結(jié)構(gòu)基因，使細菌不產(chǎn)生半乳糖苷酶。這種情況下，細菌便會自動優(yōu)先利用葡萄糖，因為葡萄糖果是比乳糖更加好能源。47/62…RPOS1S2…

…DNA調(diào)整基因開啟基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因與阻遏蛋白結(jié)合1.RNA聚合酶結(jié)合位點2.cAMP及其受體蛋白復(fù)合物（cAMP-CRP）結(jié)合位點產(chǎn)生阻遏蛋白mRNA操縱子48/62誘導(dǎo)型操縱子無誘導(dǎo)物——不表示或低表示、有誘導(dǎo)物——轉(zhuǎn)錄成mRNA——合成酶阻遏型操縱子無誘導(dǎo)物——正常表示有誘導(dǎo)物——轉(zhuǎn)錄受阻49/62（2）原核生物中酶生物合成調(diào)整機制a.分解代謝物阻遏作用b.酶生物合成誘導(dǎo)作用c.酶生物合成反饋阻遏作用50/62a.分解代謝物阻遏作用是指輕易利用碳源經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生物質(zhì)阻遏一些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成現(xiàn)象。cAMP↓+H2OAMP↓磷酸二酯酶葡萄糖過量降解ATPADP,AMPcAMP-CRP↓開啟基因上沒有cAMP-CRP結(jié)合酶合成↓例：葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶生物合成實質(zhì)：cAMP經(jīng)過開啟基因?qū)γ干锖铣蛇M行調(diào)整控制。51/62b.酶生物合成誘導(dǎo)作用加進某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進行過程。舉例：乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶合成…RPOS1S2…DNA無誘導(dǎo)物時：添加誘導(dǎo)物時：…RPOS1S2…DNA誘導(dǎo)物轉(zhuǎn)錄翻譯mRNA酶乳糖別乳糖52/62c.酶生物合成反饋阻遏作用（產(chǎn)物阻遏作用）是指酶催化作用產(chǎn)物或代謝路徑末端產(chǎn)物使該酶生物合成受阻過程。舉例：無機磷酸阻遏堿性磷酸酶無阻遏物時：添加阻遏物時：…RPOS1S2…DNA翻譯mRNA…RPOS1S2…DNA共阻遏物磷酸單酯磷酸+醇堿性磷酸酶53/62（3）酶生物合成模式細胞在一定條件下培養(yǎng)生長，其生長過程普通經(jīng)歷調(diào)整期、生長久、平衡期和衰退期等4個階段經(jīng)過分析比較細胞生長與酶產(chǎn)生關(guān)系,能夠把酶生物合成模式分為4種類型。即同時合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。

54/62a、同時合成型

酶生物合成與細胞生長同時進行一個酶生物合成模式。該類型酶生物合成速度與細胞生長速度緊密聯(lián)絡(luò)，又稱為生長偶聯(lián)型。

大部分組成酶生物合成屬于同時合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進行生物合成。比如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸培養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（tanaseEC3.1.1.20）。55/62屬于同時合成型酶，其生物合成伴伴隨細胞生長而開始；在細胞進入旺盛生長久時，酶大量生成；當(dāng)細胞生長進入平衡期后，酶合成伴隨停頓。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細胞濃度活細胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度特點：該類酶所對應(yīng)mRNA很不穩(wěn)定，其壽命一般只有幾十分鐘，細胞進入平衡期后，新mRNA不再生成，原有mRNA被降解，酶生物合成停頓。mRNA不穩(wěn)定，無阻遏作用56/62b、延續(xù)合成型

酶生物合成在細胞生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還能夠延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型酶能夠是組成酶，也能夠是誘導(dǎo)酶。比如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）生物合成。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物以含有葡萄糖果膠為誘導(dǎo)物特點：這些酶所對應(yīng)mRNA相當(dāng)穩(wěn)定，在平衡期后仍可合成相對應(yīng)酶mRNA穩(wěn)定，不受阻遏57/62c.中期合成型

該類型酶在細胞生長一段時間以后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶生物合成也伴隨停頓。比如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)生物合成模式屬于中期合成型。細胞濃度mg/ml酶濃度U/ml特點：酶生物合成受產(chǎn)物或分解代謝產(chǎn)物阻遏作用，而酶對慶mRNA穩(wěn)定性較差mRNA不穩(wěn)定，受阻遏58/62d.滯后合成型

這類型酶是在細胞生長一段時間或者進入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許