第二節(jié)、基因工程的基本操作程序教學(xué)目標(biāo)1.闡明基因工程的原理和基本操作程序。2.針對人類生產(chǎn)或生活中的某一需求,選取適當(dāng)?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法,嘗試設(shè)計獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。3.嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。從社會中來1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測與鑒定3.2基因工程的基本操作程序（四個步驟）如從蘇云金桿菌提取的Bt抗蟲蛋白基因就是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因一、目的基因的篩選與獲?、俑拍睿涸诨蚬こ痰脑O(shè)計和操作中,用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物的基因。閱讀教材76頁相關(guān)內(nèi)容，回答下列問題：什么是目的基因，主要是指哪一類基因？舉例說明？根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因②類型:1.目的基因:如何篩選目的基因？從哪里獲得目的基因呢？明確了目的基因后，該怎樣獲取它呢？2.篩選目的基因的依據(jù)：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選。①人工合成②基因文庫③PCR擴增3.獲取目的基因方法：在目的基因的核苷酸序列已知的情況下常利用PCR特異性的快速擴增目的基因4.利用PCR獲取和擴增目的基因:（1）PCR的全稱：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（3）PCR原理：DNA半保留復(fù)制（2）PCR定義及發(fā)明人：參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶(體外用高溫代替)打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)制模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸（4）DNA復(fù)制所需基本條件：（5）PCR反應(yīng)需要哪些條件？①一定的緩沖液（一般要加Mg2+__激活DNA聚合酶）②DNA模板③分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物（人工合成的與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸）使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸.PCR為人工合成的單鏈DNA，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制引物為RNA。④4種脫氧核苷酸必須有目的基因上一段已知序列,以便設(shè)計引物實際加入的是四種三磷酸脫氧核糖核苷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP,提供原料的同時提供能量，不需要加入ATP。⑤耐高溫的DNA聚合酶⑥控制溫度（6）擴增的過程：一般分為變性、復(fù)性、延伸三步變性:90℃以上,雙鏈DNA解旋為單鏈復(fù)性:當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合延伸:溫度上升到72℃左右時，4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈即將4種脫氧核苷酸加到引物的3′端第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物（6）擴增的過程：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成指數(shù)形式擴增（約為2n

，n為擴增循環(huán)的次數(shù)）（7）擴增特點：例如：1個DNA分子進行PCR擴增,循環(huán)4次，理論上至少需要（24-1）×2=30個引物。2×（2n-1）成指數(shù)形式擴增（8）儀器：PCR擴增儀（9）鑒定方法：瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶，邊解旋邊復(fù)制高溫解旋，雙鏈完全分開場所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外(PCR擴增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件高溫結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因相同原則堿基互補配對條件原料、模板、能量、酶、引物子鏈延伸方向5′端到3′端（從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸）5、人工合成法：適用對象：基因比較小、核苷酸序列已知方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因6、基因文庫獲?。海康幕虻暮塑账嵝蛄形粗?）概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫（2）基因文庫類型：（包含一種生物的所有基因）（包含一種生物的一部分基因）（3）基因組文庫與cDNA文庫的構(gòu)建過程比較基因組文庫（以原核生物為主）cDNA文庫（真核生物）某生物體內(nèi)全部DNA某種生物某個時期的mRNA旁欄思考題1.用PCR技術(shù)可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程是：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA鏈，形成雙鏈DNA分子1、在遺傳工程中，若有一個控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進行人工復(fù)制，復(fù)制時應(yīng)給予的條件是①雙鏈DNA分子為模板②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥耐高溫的DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D2、在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸是460個）放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是A.540個 B.8100個 C.17280個 D.7560個B能編碼出人們所需要的蛋白質(zhì)的基因請閱讀教材80頁相關(guān)內(nèi)容，討論回答：二.基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心工作構(gòu)建基因表達載體的目的？基因表達載體的組成是什么？分別有何作用？1.目的：②使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代2.基因表達載體的組成（是載體的一種）a.目的基因基因表達載體與載體相比增加了目的基因。目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間的部位，否則目的基因?qū)o法表達c.啟動子d.終止子①位置：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游②作用：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA①位置：也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游②作用：終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。e.復(fù)制原點：DNA聚合酶結(jié)合位點，復(fù)制的起點有時為何會在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動子？b.標(biāo)記基因鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用抗性基因作為標(biāo)記基因原核生物基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游真核生物基因結(jié)構(gòu)同種或能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶3.基因表達載體的構(gòu)建過程：質(zhì)粒（載體）DNA分子一個或兩個切口兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子4.基因表達載體構(gòu)建的過程用到哪些工具？用DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)產(chǎn)物有：目的基因—目的基因、目的基因—載體、載體—載體3種工具有：限制酶、DNA連接酶、載體5.構(gòu)建基因表達載體時選用什么樣的限制酶？選用同種限制酶或者能產(chǎn)生相同末端的兩種限制酶用兩種限制酶同時切割載體和含目的基因的DNA分子可防止目的基因自身環(huán)化和反向連接6.基因表達載體的啟動子、終止子的作用，與起始密碼、終止密碼是否相同？基因表達載體的構(gòu)建會因受體細(xì)胞及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同而有所差別。項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段mRNA上三個相鄰堿基（AUG）mRNA上三個相鄰堿基（UAA等）位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄翻譯的起始點終止翻譯2.將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。旁欄思考題三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法——顯微注射法——鈣離子處理法實際導(dǎo)入受體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是什么？基因工程常用的受體細(xì)胞有哪些？（一）受體細(xì)胞：動、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞（1）花粉管通道法②滴注法：在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。我國科學(xué)家獨創(chuàng)1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞受體細(xì)胞:體細(xì)胞或受精卵①注射器注入法:用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中花粉卵細(xì)胞精子花粉管（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②侵染植物類型:能侵染雙子葉植物和祼子植物,對大多數(shù)單子葉植物無感染能力①轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程③農(nóng)桿菌的特性：農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T—DNA（即轉(zhuǎn)移DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞并將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法利用了農(nóng)桿菌的什么特性？③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色體的DNA植物組織培養(yǎng)表現(xiàn)新性狀的植株轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌根據(jù)受體植物的不同，所用的具體轉(zhuǎn)化方法有所區(qū)別兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

據(jù)圖可知，目的基因發(fā)生了幾次拼接和導(dǎo)入？發(fā)育體外培養(yǎng)2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞②方法:顯微注射技術(shù)③操作程序:含目的基因的表達載體受精卵顯微注射雌性動物的子宮具有新性狀的動物①常用受體細(xì)胞:受精卵早期胚胎顯微注射法胚胎移植讓轉(zhuǎn)基因猴全身體細(xì)胞都帶有目的基因，選擇怎樣的受體細(xì)胞？3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞①常用法：Ca2+處理（感受態(tài)細(xì)胞法）②常用菌：大腸桿菌③微生物作受體細(xì)胞原因：④過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對少對受體細(xì)胞常用Ca2+處理的目的什么？感受態(tài)細(xì)胞具有什么特點？Ca2+處理的目的是增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性感受態(tài)細(xì)胞的特點是通透性增強，易吸收DNA實例：利用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生產(chǎn)藥物（胰島素）

原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進行再加工。生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌作為受體細(xì)胞嗎？不可以，糖蛋白上的糖側(cè)鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器在生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時,酵母菌比大腸桿菌有優(yōu)勢。1、基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的，在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成基因B.目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測和表達C2.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C按前面三個步驟進行了操作，是否可以確定目的基因進入了受體細(xì)胞并能維持穩(wěn)定？是否可以確定目的基因一定能夠進行表達？是否可以確定得到了新的性狀？不一定！如何判斷？四、目的基因的檢測與鑒定1、分子水平的檢測檢測：③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因檢查轉(zhuǎn)基因生物是否培育成功的一步2、個體生物學(xué)水平的鑒定PCR技術(shù)檢測1、分子水平的檢測①方法：DNA分子雜交（DNA與DNA雜交），PCR技術(shù)②過程：探針是用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的與目的基因互補的特異核苷酸序列（或目的基因的單鏈DNA片段）（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵：①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中。15N15N變性變性基因探針待測DNA知識延伸——DNA分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：方法：核酸分子雜交（DNA與RNA雜交），PCR技術(shù)通常以目的基因表達產(chǎn)物(蛋白質(zhì))作抗原,制備相應(yīng)抗體,檢測轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì),利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。過程：探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA現(xiàn)象：是否出現(xiàn)雜交帶抗原-抗體雜交技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)基因生物培育是否成功有沒有更簡便、直接的方法？2、個體生物學(xué)水平的鑒定抗蟲、抗病鑒定（抗蟲或抗病的接種實驗）活性鑒定等檢測棉花中導(dǎo)入的抗蟲基因是否表達的最簡便的方法是？用葉片飼養(yǎng)棉鈴蟲，觀察棉鈴蟲是否死亡通過相應(yīng)病原微生物感染生物來確定相應(yīng)抗病基因是否賦予了受體生物抗病特性以及抗性的程度。目的基因的檢測與鑒定小結(jié)：基因工程的基本操作流程圖歸納:基因工程的基本操作程序DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)和抗原—抗體雜交技術(shù)到社會中去1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉(zhuǎn)濟基因的抗蟲棉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗性？證據(jù)是什么？這是一個開放性的問題，需要學(xué)生查找資料來回答。隨著田間監(jiān)測數(shù)據(jù)的更科研論文發(fā)表，每年學(xué)生獲得的證據(jù)是不一樣的。例如，科研人員對長江流域種植的抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標(biāo)害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等基因的抗蟲棉產(chǎn)生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種。教師要注意引導(dǎo)學(xué)生搜集的證據(jù)，如科研論文、權(quán)威的官方報道等。2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應(yīng)該想辦法應(yīng)對，他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的措施有很多，主要可以分為幾個方面。(1)基因策略。該策略是在分子水平上提高轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性，包括在棉花中轉(zhuǎn)入多個殺蟲基因、構(gòu)建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉(zhuǎn)入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CryIAc基因)同時轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。(2)田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉(zhuǎn)基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花，或在轉(zhuǎn)基因棉田周圍種植20%~30%面積的可使用化學(xué)殺蟲劑的非轉(zhuǎn)基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉(zhuǎn)基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉(zhuǎn)基因棉花。我國除新疆棉區(qū)及大型農(nóng)場需設(shè)計專門的庇護所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構(gòu)成天然的庇護所，一般無須種植非轉(zhuǎn)基因棉花作為庇護所。這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標(biāo)害蟲種群。這樣，即使目標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因抗蟲棉產(chǎn)生了抗性，但是因為其與敏感目標(biāo)害蟲交配，后代抗性基因會發(fā)生分離，所以抗性目標(biāo)害蟲的種群也不至于迅速增加。(3)國家宏觀調(diào)控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴(yán)格的安全性評價等。1.基因工程的基本操作程序有：①目的基因的篩選和獲取；②基因表達載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；④目的基因的檢測與鑒定。2.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。其獲取方法主要有①利用PCR技術(shù)獲?、谌斯ず铣散刍蛭膸熘蝎@取3.基因表達載體由目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等組成。4.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有：①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法；②花粉管通道法。5.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞常用的方法是顯微注射法。6.目的基因的檢測方法有DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)和抗原—抗體雜交技術(shù)。有時還需進行個體生物學(xué)水平的鑒定。核心回扣練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測1.研究人員將一種海魚的抗凍蛋白基因加整合到土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上，然后用它侵染番茄細(xì)胞，獲得了抗凍的番茄品種。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）將加基因整合到Ti質(zhì)粒上就是構(gòu)建基因表達載體。（2）構(gòu)建含有加基因的Ti質(zhì)粒需要限制酶、DNA連接酶和核酸酶。（）（3）只要檢測出番茄細(xì)胞中含有物基因，就代表抗凍番茄培育成功。（

）2.利用PCR既可以快速擴增特定基因，也可以檢測基因的表達。下列有關(guān)PCR的敘述錯誤的是（）A.PCR用的DNA聚合酶是一種耐高溫酶B.變性過程中雙鏈DNA的解開不需要解旋酶C.復(fù)性過程中引物與模板鏈結(jié)合遵循堿基互補配對原則D.延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP和4種核糖核苷酸√××D二、拓展應(yīng)用1.研究人員在研究轉(zhuǎn)基因煙草中外源卡那霉素抗性基因的遺傳穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)44株轉(zhuǎn)基因煙草中有4株該基因的遺傳不符合孟德爾遺傳規(guī)律，在它們的自交后代中出現(xiàn)了較多的沒有卡那霉素抗性的植株。請查找相關(guān)資料，嘗試對這個問題作出解釋。外源基因插入基因組中可能為單位點插入，或者同一染色體