限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)檢測方法Assaymethodofrestrictionendonucleaseimpurity2022-10-12發(fā)布國家標準化管理委員會I l2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14原理 15試劑或材料 16儀器設(shè)備 27試驗步驟 2附錄A(規(guī)范性)瓊脂糖凝膠電泳 4Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由全國工具酶標準化工作組(SAC/SWG11)提出并歸口。本文件起草單位：福建南生科技有限公司、通用生物(安徽)股份有限公司、夏禾(深圳)生物技術(shù)有限公司、廈門銀祥集團有限公司、蘇州坤琪生物科技有限公司、廈門中集信檢測技術(shù)有限公司、上海鷹姿生命科技有限公司、雷谷(廈門)生物醫(yī)藥有限公司、北京化工大學、山東大學、安琪酵母股份有限公司、復旦大學、武漢科技大學、北京中天標科標準化技術(shù)研究院有限公司、廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶是一類識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA,產(chǎn)生5'-PO?和3'-OH末端。限制性核酸內(nèi)切酶的作用底物是脫氧核糖核酸(DNA),其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的污染會導致底物的降解或消失，降低其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的污染是限制性核酸內(nèi)切酶最重要的質(zhì)量保證。制定限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)檢測方法國家標準，用以推動該類工具酶的產(chǎn)業(yè)化，對于限制性核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)和使用具有重要的意義。1限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)檢測方法本文件描述了限制性核酸內(nèi)切酶中污染其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶等雜質(zhì)的檢測方法。本文件適用于限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)的檢測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。以內(nèi)切方式水解DNA,產(chǎn)生5'-PO?和3'-OH末端，識別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶。影響核酸底物存在的其他核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶。帶，它們的大小及核苷酸順序均為已知。樣品中無其他核酸內(nèi)切酶污染，酶解產(chǎn)物在電泳板上形成的譜帶與酶解時間過長、用酶過多無關(guān)。由于BamHI切開DNA雙鏈產(chǎn)生一對黏性末端，其各有5個堿基失去互補堿基形成突出單鏈，其易受核酸外切酶作用丟失若干個堿基乃至形成平末端；如果將此DNA連接后再用BamHI酶切，結(jié)果是無法切開。如果該位點是在外顯子區(qū)或編碼區(qū)，即意味其對應(yīng)的氨基酸序列發(fā)生變化，乃至某些生物性狀發(fā)生改變。例如質(zhì)粒pBR322所含BamHI識別位點是在其抗四環(huán)素基因上，如果使用被核酸外切酶污染的樣品BamHI過量長時程切割pBR322,然后再連接閉環(huán)后重新轉(zhuǎn)化受體菌，該菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上無法生長，而沒有這樣酶切的pBR322轉(zhuǎn)化菌能夠生長。又如質(zhì)粒pUC19所含BamHI位點居于編碼LacZ的α互補肽上，若發(fā)生前述狀況，就會導致該肽鏈的氨基酸序列變化，最終在含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基上由原本是藍斑變成白斑。如果白斑數(shù)目占到總菌斑數(shù)的10%以上，就判定該樣品已有核酸外切酶污染。5試劑或材料25.2φX174噬菌體脫氧核糖核酸(φX174DNA)。5.3瓊脂糖。5.4共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒pUC19DNA(cccpUC19DNA)。5.5T4噬菌體DNA連接酶(T4DNA連接酶)。5.6LB培養(yǎng)液。5.7三氯甲烷-異戊醇(24:1,體積比):24mL三氯甲烷、1mL異戊醇。5.8大腸桿菌DH。(感受態(tài)):通過處理使大腸桿菌DH。細胞的通透性變大，便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。5.9LB平板(含X-gal、IPTG、氨芐青霉素):胰蛋白胨10g、酵母抽提物5g、氯化鈉10g、瓊脂粉15g,加入純化水至1L,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,121℃高壓滅菌20min,待冷卻至50℃~6儀器設(shè)備7試驗步驟7.1其他核酸內(nèi)切酶檢測7.1.1長時程過量酶切反應(yīng)取4只1.5mLEP管，管1#、管2#、管3#、管4#;管1#和管2#各加入1μgλDNA,管3#和管4#各加入1μgφX174DNA;每管加入5μL10×反應(yīng)緩沖液，管1#、管2#、管3#加入10U(1μL)BamHI,管4#不加BamHI,均加入純化水至50μL,混勻，37℃酶切，1h后取出管1#,置冰箱待電泳檢測；10h后取出管2#、管3#、管4#,置冰箱待電泳檢測。在1%～1.5%瓊脂糖凝膠、電泳電壓為5V/cm～10V/cm的條件下，當溴酚藍線到達凝膠板2/3的位置時停止電泳，取出凝膠板置于紫外透光分析儀觀察和拍照。按附錄A的方法進行電泳檢測。在電泳板上，肉眼觀察。若管1#和管2#的譜帶一致，管3#和管4#的譜帶一致，則判定樣品中不含其他核酸內(nèi)切酶；若管1#和管2#的譜帶不一致或(和)管3#和管4#的譜帶不一致，則判定樣品中含其他核酸內(nèi)切酶。7.2核酸外切酶檢測7.2.1長時程過量酶切取5μg高純度cccpUC19DNA置于一只1.5mLEP管里，加入10μL10×BamHI緩沖液，5μLBamHI(50U～100U),加入純化水至總體積100μL;混勻后置于37℃水浴槽，1h后取出40μL,其中20μL(管1#)待電泳檢測，另20μL(管2#)待連接及藍白斑計數(shù)；所剩60μL繼續(xù)酶切達10h以上，再將其均分為三管，分別標記管3#、管4#、管5#。37.2.2.1取出管1#和管3#,加入載樣緩沖液，準備電泳檢測。7.2.2.2在1.5%瓊脂糖，電泳電壓5V/cm～10V/cm的條件下，當溴酚藍線到達凝膠板2/3位置時停止電泳，取出凝膠板置于紫外透光分析儀觀察和拍照。按附錄A的方法進行電泳檢測。取出管2#、管4#、管5#,各加入20μL三氯甲烷-異戊醇先脫去雜蛋白，再沉淀出DNA,并真空干燥樣品。每管加入2μL10×T?DNA連接酶緩沖液，2UT?DNA連接酶，加入純化水至總體積20μL,混勻后置于15℃水浴槽水浴8h。7.2.3.3.1將感受態(tài)菌液加入含連接處理過的DNA的EP管內(nèi)，輕混，置于4℃冰浴槽水浴0.5h以上。7.2.3.3.2將上述三只EP管移到42℃水浴中熱擊2min,迅即取出再置于4℃冰浴槽水浴0.5h以上。7.2.3.3.3向上述三只EP管各加入1mLLB培養(yǎng)液，輕混，置于37℃水浴槽水浴1h。7.2.3.3.4將15塊固態(tài)LB板，分別標上管2#、管4#、管5#,每號均有5塊板；在超凈工作臺鋪板，每板加入上述菌液200μL;待板上菌液停止流動時，翻轉(zhuǎn)平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱8h以上。7.2.3.3.5計算每塊板藍白斑數(shù)量，再算出每號管對應(yīng)的每個處理的藍白斑總數(shù)及百分比。7.2.4.1在電泳板上，管1#和管3#的譜帶沒有明顯差異，說明長時程過量酶處理對DNA沒有造成額外的切割。7.2.4.2管2#、管4#、管5#的白斑總數(shù)與其藍斑總數(shù)相比。若比值小于1/9,則判定樣品不含外切核酸酶；若比值大于或等于1/9,則判定樣品含有核酸外切酶。4(規(guī)范性)瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳，是以瓊脂糖為介質(zhì)，對不同大小的DNA實現(xiàn)分離的一種電泳方法。瓊脂糖是一種多糖，具有親水性，但是不帶電荷。當在堿性條件下時，DNA帶負電，在電流作用下，可以瓊脂糖凝膠為介質(zhì)，由負極向正極移動，不同DNA分子片段的大小和性狀不同，在凝膠中的泳動速率也不同，導致電泳后的DNA分子通過染料嵌合和紫外線照射而顯示出在凝膠電泳中不同的位置。A.2試劑或材料A.2.1瓊脂糖。A.2.3溴化乙錠(EB)。A.3儀器設(shè)備A.4實驗步驟A.4.2根據(jù)欲分離DNA片段大小用1×TAE緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖溶液，應(yīng)準確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的1×TAE緩沖液的三角燒瓶中搖勻，置于微波爐加熱至瓊脂糖完全熔化。A.4.3將瓊脂糖凝膠液稍微冷卻后加入溴化乙錠，終濃度為0.5μg/mL,輕輕旋轉(zhuǎn)燒瓶充分