用于病原微生物高通量檢測(cè)的核酸提取技術(shù)規(guī)范國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40458—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40458—2021用于病原微生物高通量檢測(cè)的核酸提取技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)病原微生物進(jìn)行高通量檢測(cè)的核酸的提取要求，描述了對(duì)應(yīng)的提取方法。本文件適用于植物及其產(chǎn)品的植物病原細(xì)菌、真菌、病毒和病媒生物攜帶的細(xì)菌的核酸提取方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T2752.4衛(wèi)生檢疫人員的自我防護(hù)規(guī)范第4部分：實(shí)驗(yàn)室人員SN/T2776國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)媒介生物監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室管理要求SN/T4278—2015國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程SN/T4625—2016DNA條形碼篩選與質(zhì)量要求3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)OD:光密度(OpticalDensity)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)5總體要求核酸提取主要包括生物樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的離的過(guò)程。核酸提取應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性。排除其他分子，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機(jī)溶劑等的污染，保證下游高通量檢測(cè)試驗(yàn)順利進(jìn)行。試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)防止外界環(huán)境(如灰塵、氣溶膠、RNA酶等)對(duì)核酸提取的污染，以及病原物本身及試2GB/T40458—2021驗(yàn)過(guò)程中的廢棄物、廢棄液等對(duì)環(huán)境的污染。在整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程中應(yīng)采用安全有效的防護(hù)措施。具體要求應(yīng)符合GB19489、SN/T2752.4、SN/T2776中的規(guī)定。6提取步驟6.1細(xì)胞裂解從組織中提取核酸應(yīng)先將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，然后破碎胞膜及核膜，使核酸釋放出來(lái)。從各種不同來(lái)源的樣品中提取高純度的病原微生物核酸，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含成分不同，樣品預(yù)處理的方式也不6.2核酸的分離純化核酸樣品中不應(yīng)存在其他生物大分子(如蛋白質(zhì)、多糖、多酚和脂類等),以及不應(yīng)存在對(duì)酶(如核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶等)有抑制作用的成分。同時(shí)，應(yīng)排除其他核酸分子的污染，例如，DNA樣品中應(yīng)去除污染的RNA,反之RNA中應(yīng)去除DNA。針對(duì)不同來(lái)源樣品的具體核酸提取方法按附錄A和附錄B的規(guī)定執(zhí)行。6.3核酸質(zhì)量檢測(cè)將提取的核酸樣品(DNA或RNA)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳或芯片檢測(cè)，并與核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。完整性較好的DNA樣品呈現(xiàn)出明顯而清晰的單一條帶，完整性較好的RNA樣品呈現(xiàn)出三條帶，亮度依次遞減。利用儀器檢測(cè)核酸的濃度及純度：核酸濃度可在儀器上直接讀出，核酸樣品純度用OD?so/OD?so值檢測(cè)，純度較高的DNAOD?so/OD?so值應(yīng)為1.7～1.9,RNAOD?o/OD?so值應(yīng)為1.8～2.0。6.3.3PCR法進(jìn)一步檢測(cè)核酸質(zhì)量宜采用PCR法進(jìn)一步檢測(cè)核酸質(zhì)量，按照SN/T4278—2015中的7.4執(zhí)行，擴(kuò)增引物按照SN/T4625—2016中的8章、9章執(zhí)行。出現(xiàn)目的片段的擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后續(xù)高通量檢測(cè)。細(xì)菌、真菌高通量檢測(cè)宜采用擴(kuò)增子測(cè)序分析，病毒高通量檢測(cè)宜采用小RNA測(cè)序分析。7樣品保存與記錄提取出的核酸樣品應(yīng)先進(jìn)行分裝，妥善保存在-80℃超低溫冰箱中，以保證其在后續(xù)分析中的穩(wěn)7.2結(jié)果記錄應(yīng)做好樣品來(lái)源、取樣人員、核酸濃度、核酸純度、電泳結(jié)果圖等文檔的登記、標(biāo)記和存檔，便于復(fù)核。3GB/T40458—2021(規(guī)范性)植物病原微生物的核酸提取方法A.1適用范圍本方法適用于從植物及其產(chǎn)品中提取病原微生物DNA和/或RNA,適用范圍廣，可實(shí)現(xiàn)植物病原A.2試劑或材料OMEGAE.Z.N.A.TMPlantDNA/RNAKit(R6733)試劑盒1(包括：CPL緩沖液、DNA洗滌緩沖A.5提取步驟A.5.1核酸提取前處理方法稱取200mg~2g植物樣品或植物種子在液氮中研磨至粉末狀，將植物樣品粉末或植物種子粉末沖液加入20μL2-巰基乙醇混合，混合液可在室溫條件下保存1個(gè)月),55℃水浴10min。加入500μL三氯甲烷，振蕩30s,13000r/min離心5min。DNA吸附柱(DNA吸附柱放入2mL收集管中),10000r/min離心1min,將DNA吸附柱放置室溫或4℃待后續(xù)用于DNA提取，洗脫液用于后續(xù)RNA提取。A.5.2DNA提取將A.5.1所得DNA吸附柱放入新的2mL離心管中，向DNA吸附柱中加入500μLDNA洗滌緩向DNA吸附柱中加入500μLDNA洗滌緩沖液，14000r/min離心2min,棄掉濾液。可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間以保證DNA吸附柱徹底干燥。4GB/T40458—2021A.5.3RNA提取將700μL液體A轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱(RNA吸附柱放入2mL收集管中),10000r/min離心1min,棄掉濾液。將剩余溶液A所得液體轉(zhuǎn)移至RNA吸附柱，10000r/min離心1min,棄掉濾液。向RNA吸附柱中加入500μLRWC洗滌緩沖液，10000r/min離心1min,棄掉濾液。向RNA吸附柱中加入500μLRNA洗滌緩沖液Ⅱ(使用前按說(shuō)明要求加入相應(yīng)量的無(wú)水乙醇),10000r/min離心1min,棄掉濾液。向RNA吸附柱中加入500μLRNA洗滌緩沖液Ⅱ,10000r/min離心2min,棄掉濾液?？蛇m當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間以保證RNA吸附柱徹底干燥。將RNA吸附柱放入新的1.5mL離心管中，向吸附膜中間懸空滴加40pL～70μL焦碳酸二乙酯(DEPC)洗脫緩沖液，室溫放置2min,14000r/5GB/T40458—2021(規(guī)范性)病媒生物攜帶細(xì)菌性樣品的核酸提取方法B.1適用范圍本方法適用于利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)本底調(diào)查或口岸截獲的病媒生物攜帶未知細(xì)菌進(jìn)行高通量檢測(cè)鑒定的DNA提取工作。B.2試劑或材料B.4樣品攜帶未知細(xì)菌的病媒生物。B.5提取步驟B.5.1DNA提取前處理方法B.5.1.1體表攜帶細(xì)菌的收集方法的0.9%NaCl溶液，800r/min漩渦振蕩30s收集廢棄液和廢棄物高壓滅菌后丟棄。B.5.1.2體內(nèi)攜帶細(xì)菌的收集方法將B.5.1.1處理后病媒生物移入新的滅菌離心管中，加入可浸沒(méi)病媒生物的75%乙醇浸泡5min,重復(fù)3次；將病媒生物轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的滅菌離心管中，然后加入可浸沒(méi)病媒生物的0.9%NaCl溶液，800r/min漩渦振蕩30s,棄上清，以上步驟重復(fù)3次。將樣本放置在生物安全柜中晾干15min。用滅菌鑷子將樣本移入新離心管中，將標(biāo)本研碎成糊狀。2)天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的TIANampBacteriaDNAKit(DP302)試劑盒是適合的市售產(chǎn)品的實(shí)例。給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。6GB/T40458—202112000r/min離心2min,棄上清，留沉淀。重復(fù)以上收集步驟3次，將收集的細(xì)菌沉淀物，加入500μL收集廢棄液和廢棄物高壓滅菌后丟棄。若是提取鼠體內(nèi)細(xì)菌，取其內(nèi)臟組織進(jìn)行試驗(yàn)，無(wú)需進(jìn)行B.5.1.1的處理直接進(jìn)行該步驟。B.5.1.3整只病媒生物攜帶細(xì)菌的收集方法取1只病媒生物或組織置于適中的離心管中，將標(biāo)本研碎成糊狀。根據(jù)樣本大小加入適量0.9%NaCl溶液，800r/min漩渦振蕩30s,短暫離心，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，12000r/min離心2min,棄上清，留沉淀。重復(fù)以上收集步驟3次，將收集的細(xì)菌沉淀物，加入500μL0.9%NaCl溶液懸浮后合并，4℃保存?zhèn)溆?。收集廢棄液和廢棄物高壓滅菌后丟棄。B.5.2細(xì)菌基因組DNA的提取將裝有菌液的離心管12000r/min離心2min,轉(zhuǎn)移上清液并高壓滅菌處理。收集沉淀進(jìn)行細(xì)菌a)向離心管內(nèi)加入180μL溶菌酶溶液(20mg/mL)和20μL蛋白酶K溶液，用移液器吸打混勻；b)加入220μL緩沖液GB,振蕩15s,70℃放置10min,溶液應(yīng)變的清亮，簡(jiǎn)短離心去除管蓋和c)加入220μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15s,此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心去除管蓋和內(nèi)壁的水珠；d)將上一步所得的溶液和絮狀沉淀都加入到一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12000r/min離心30s,棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；e)向吸附柱CB3中加入500μL緩沖液GD(使用前應(yīng)檢查是否加入無(wú)水乙醇),12000r/min離心30s,棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；f)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前應(yīng)檢查是否加入無(wú)水乙醇),12000r/min離心30s,棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；g)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,